[发明专利]一种快速创制转基因玉米双单倍体纯合后代的方法

摘要

本发明公开了一种快速创制转基因玉米双单倍体纯合后代的方法，与现有技术相比，本发明用玉米单倍体诱导系东诱1号为父本给转基因玉米杂交种授粉，挑取单倍体幼胚进行组织培养，利用秋水仙素给单倍体幼胚进行染色体组加倍，进而培养转基因双单倍体玉米植株，并收获转基因双单倍体种子。本发明可用于转基因玉米回交转育后代的快速纯合，也可用于玉米双单倍体群体的快速建立，进行玉米重要性状的遗传分析。

主权项

一种快速创制转基因玉米双单倍体纯合后代的方法，其特征在于：包括试验材料：玉米单倍体诱导系东诱1号、L7和JY3，为东北农业大学农学院玉米课题组选育，具有R‑nj标记；用于创建单倍体的F1杂交种，其母本为转玉米精氨酸酶ZmARG基因玉米HiII的T2代株系，父本为合344；上述常规玉米材料公众可从东北农业大学农学院玉米课题组获得；试验方法：材料的种植：采用随机区组设计，3次重复，双行区，行长5m，株距30cm，行宽70cm，每行17株；两地田间管理标准一致，同普通玉米生产田；5米行长，株距30cm，行距70cm；杂交种一次播种，时间为当年4月29日，诱导系分3期播种，时间分别为当年4月29日，5月7日和5月11日；授粉：用诱导系给F1杂交种授粉，挂牌记录授粉时间，每个诱导系至少授10株；组织培养的试验流程：培养基：(1)筛选培养基：MS液体培养基+100uM ABA；(2)加倍培养基：MS液体培养基+2mg/L天冬酰胺+1mg/L BAP+0.05％的秋水仙素；(3)生长培养基：MS固体培养基；操作方法：(A)幼穗的消毒分别在授粉后18d，20d取幼穗，剥去苞叶，在75％乙醇中灭菌8min，0.1％HgCl2消毒6min，无菌水冲洗3次；(B)幼胚的剥取：取幼胚，盾片朝下置于培养皿中用筛选培养基浸润的无菌滤纸上，28℃，16h光照/8小时黑暗，培养24h；(C)单倍体幼胚的加倍：挑选出盾片无色素沉着的单倍体幼胚，盾片朝上接种到培养皿中用加倍培养基浸润的无菌滤纸上，26℃黑暗培养24h；(D)幼胚培养：将幼胚转移至生长培养瓶中，盾片向下，26℃暗培养1周，之后26℃光培养2‑3周直至根发育完全；每瓶接种15个左右；(E)移栽：将小苗移栽至土壤基质中，温室内培养，根据叶鞘颜色鉴别单倍体植株，直至成熟，严格自交，收获种子；(F)双单倍体的PCR检测：采用CTAB小量法提取玉米幼苗叶片的总DNA；由于ZmARG基因为玉米内源基因，根据启动子Ubi序列和目的基因序列设计引物，引物ARG‑F位于启动子Ubi序列内部，引物ARG‑R位于目的基因序列内部，产物大小为775bp；筛选标记基因为抗除草剂草甘膦基因，产物大小为522bp；引物序列如下：ARG‑F:5’‑CGCCCTTCTTTGGTGAT‑3’ARG‑R:5’‑CCCTGCCTTCATACGCT‑3’PCR反应程序为，94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，72℃8min，32个循环；1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物；数据统计方法:单倍体的诱导率＝单倍体幼胚数/接种幼胚数*100％；加倍率＝结实株数/再生苗数*100％；采用Excel 2010对试验数据进行初步整理，使用统计分析软件SPSS Statistics 17.0中独立样本T检验和方差分析程序进一步分析。