[发明专利]一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法

摘要

本发明公开了一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法，属于微生物技术领域。该发酵制备得到葡萄糖氧化酶具有高的耐热性和耐酸性，解决了在食品及饲料中因高温及酸性环境中使用导致的酶活力低的缺陷。具体步骤如下：将菌种培养成孢子并将孢子清洗后制备单孢子菌悬液；将单孢子菌悬液接入种子培养基中发酵培养；将种子培养液接入摇瓶发酵培养基中发酵培养，将发酵补充营养液加入发酵液中；糊精、可溶性淀粉及山梨酸钾加入发酵液中并搅拌均匀，将发酵液冷冻，干燥并粉碎，得葡萄糖氧化酶。发酵得到的葡萄糖氧化酶粗酶液经过热处理、硫酸铵‑乙醇复合沉淀及离子交换层析和分子筛凝胶过滤层析，得到高回收率高纯度的葡萄糖氧化酶。

主权项

一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)将嗜热拟青霉菌种在PDA活化培养基平板上划线活化，并将PDA活化培养基平板置于30～40℃的恒温培养箱中活化培养48～72h，即得嗜热拟青霉丝；(2)用接种环刮取步骤(1)中所制备的嗜热拟青霉丝接种于斜面培养基上，并将斜面培养基置于30～40℃的条件下培养2～4d，即得孢子；(3)将步骤(2)中所制备的孢子用含有0.01％(v/v)吐温80的0.75％无菌生理盐水清洗孢子，将清洗后的孢子放入盛有50～55mL无菌生理盐水和无菌玻璃珠的锥形瓶中并充分振荡30～45min，待孢子充分分散后，制备孢子含量为1.0×108CFU/mL的孢子悬液，即得单孢子菌悬液；(4)将步骤(3)中所制备的单孢子菌悬液以4～8％(v/v)的接种量接入装有30～50mL种子培养基的三角瓶中，三角瓶在转速为160～200r/min、温度为30～45的条件下，摇床培养18～24h，即得嗜热拟青霉种子培养液；(5)将步骤(4)中所制备的嗜热拟青霉种子培养液以6～10％(v/v)的接种量接入装有150～200mL摇瓶发酵培养基的三角瓶中，三角瓶采用6层纱布封口，将封口的三角瓶在转速为160～200r/min、温度为40～45℃的条件下摇床发酵30～48h，即得嗜热拟青霉发酵培养液；(6)将60～100mL的发酵补充营养液加入步骤(5)中所制备的嗜热拟青霉发酵培养液中，即得发酵液一，待发酵液一温度降至37～40℃时，调节发酵液一的pH为5～6，并继续振动发酵，待发酵时间达72h时、温度降至28～32℃，再次向发酵液一中加入50～80mL的发酵补充营养液，并继续发酵24～48h，即得发酵液二；(7)将步骤(6)中所制备的发酵液二经4层纱布过滤，得菌丝和滤液，将滤液在转速为8000r/min的条件下离心20～30min，得沉淀和上清液，将上清液用超滤膜超滤2次，即得截留液，将所得截留液浓缩3～4倍，即得浓缩液，将所得浓缩液在60～70℃条件下旋转蒸发仪抽真空浓缩，即得粗酶液；(8)将1～2wt％的糊精、2～4wt％的可溶性淀粉和0.1～0.2wt％的山梨酸钾加入步骤(7)中所制备的粗酶液中，并搅拌均匀，即得葡萄糖氧化酶溶液，将葡萄糖氧化酶溶液置于‑20℃冷冻6～8h，将冷冻后的葡萄糖氧化酶溶液置于真空度35～45Pa、温度为‑35℃的条件下，冷冻干燥15～20h并粉碎，即得葡萄糖氧化酶酶制剂。