[发明专利]一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1;6-二磷酸酶底物位点或变构位点的方法有效
| 申请号： | 201611270093.5 | 申请日： | 2016-12-30 |
| 公开（公告）号： | CN106770122B | 公开（公告）日： | 2019-07-23 |
| 发明（设计）人： | 万坚;黄运远;徐榕;韩新亚;肖闪;任彦亮;冯玲玲;饶立 | 申请（专利权）人： | 华中师范大学 |
| 主分类号： | G01N21/64 | 分类号： | G01N21/64 |
| 代理公司： | 湖北武汉永嘉专利代理有限公司 42102 | 代理人： | 乔宇;徐晓琴 |
| 地址： | 430079 湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | 本发明属于小分子结合酶位点技术领域，具体涉及了一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6‑二磷酸酶底物位点或变构位点的方法。本发明采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6‑二磷酸酶的蛋白序列262位(底物位点)的苯丙氨酸突变为色氨酸，记为蛋白F262W；将果糖1,6‑二磷酸酶的蛋白序列89位(变构位点)的苯丙氨酸突变为色氨酸，记为蛋白F89W；利用小分子与蛋白F262W或蛋白F89W结合，引起蛋白周围环境发生变化，使得荧光发生猝灭，通过判断荧光猝灭的情况实现快速简便的判断小分子是否与果糖1,6‑二磷酸酶的底物位点或变构位点结合，本发明方法具有特异性好，灵敏度高的优点。 | ||
| 搜索关键词： | 位点 小分子 果糖 蛋白 磷酸酶 磷酸酶底物 苯丙氨酸 蛋白序列 快速判断 人体肝脏 色氨酸 荧光 底物 猝灭 定点突变技术 灵敏度 氨基酸 | ||
【主权项】：
1.一种用于快速判断小分子结合人体肝脏果糖1,6‑二磷酸酶底物位点或变构位点的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6‑二磷酸酶的蛋白序列262位(底物位点)的苯丙氨酸突变为色氨酸，记为蛋白F262W；同理，采用氨基酸定点突变技术将果糖1,6‑二磷酸酶的蛋白序列89位(变构位点)的苯丙氨酸突变为色氨酸，记为蛋白F89W；(2)将小分子与蛋白F262W结合，在不同温度下，利用荧光分光光度计检测小分子和蛋白F262W结合时的荧光猝灭过程，经数据处理后得到不同温度下小分子和蛋白F262W结合时的荧光猝灭常数，记为KSV；同理，将小分子与蛋白F89W结合，在不同温度下，利用荧光分光光度计检测小分子和蛋白F89W结合时的荧光猝灭过程，经数据处理后得到不同温度下小分子与蛋白F89W结合时的荧光猝灭常数，记为K’SV；(3)利用荧光猝灭常数KSV和K’SV进行结果判定：a.若蛋白F262W荧光猝灭且Ksv随着温度的升高而降低，则表明小分子结合在果糖1,6‑二磷酸酶的底物位点上；反之，若蛋白F262W未荧光猝灭或Ksv随着温度的升高而升高，则表明小分子未结合在果糖1,6‑二磷酸酶的底物位点上；b.若蛋白F89W荧光猝灭且K’SV随着温度的升高而降低，则表明小分子结合在果糖1,6‑二磷酸酶的变构位点上；反之，若蛋白F89W未荧光猝灭或K’SV随着温度的升高而升高，则表明小分子未结合在果糖1,6‑二磷酸酶的变构位点上。
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