[发明专利]DypB活性蛋白异源高表达的方法及应用

摘要

本发明属于基于工程技术领域,具体涉及一种DypB活性蛋白异源高表达的方法及应用。针对现有的DypB蛋白在异源表达时没有活性，需要体外结合血红素才能产生活性的问题，本发明提供一种DypB活性蛋白异源高表达的方法及应用。本发明先通过基因重组，将表达血红素的相关基因整合到宿主细胞中，使宿主存在高浓度的血红素，再将DypB构建成重组载体后，导入血红素高表达的表达宿主中，从而实现了DypB活性蛋白的异源高表达。本发明通过在表达宿主中整合血红素合成相关基因提高血红素体内积累浓度，然后通过冷诱导方式大量表达DypB，使DypB经宿主表达后具有了降解木质素的活性。

主权项

DypB活性蛋白异源高表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、构建表达宿主BL21‑AL构建表达框架，所述表达框架从5’到3’方向依次为tac启动子、核苷酸序列为Seq ID No.1的hemA基因、核苷酸序列为Seq ID No.2的hemL基因、thrA基因，插入到pET28a质粒上构建成pET28a‑hemAL；以质粒pkd3为模板，PCR扩增氯霉素抗性基因与两侧的FRT位点，添加E.coli thrA基因5′端同源臂，插入到pET28a‑hemAL，构建成pET28a‑hemAL‑Cm；将质粒pkd46转入大肠杆菌BL21(DE3)，构建成大肠杆菌BL21‑46，再将pET28a‑hemAL‑Cm导入到BL21‑46，进行red重组后，导入质粒pCP20，敲除氯霉素抗性基因，构建成表达宿主BL21‑AL；b、构建表达载体pCspA‑dypB将核苷酸序列为Seq ID No.3的DypB基因插入到pET28a载体中，构建pET28‑dypB，以E.coli为模板，PCR扩增cspA基因启动子，插入到pET28‑dypB中，构建成表达载体pCspA‑dypB；c、DypB蛋白的表达与纯化将步骤b中的表达载体pCspA‑dypB导入步骤a所述的表达宿主BL21‑AL中，IPTG诱导表达，Ni亲和层析法进行纯化，得到高纯度的DypB活性蛋白。