[发明专利]一种Candida amazonensis的FLP/FRT基因敲除方法有效
| 申请号： | 201710043801.X | 申请日： | 2017-01-19 |
| 公开（公告）号： | CN106636177B | 公开（公告）日： | 2020-01-21 |
| 发明（设计）人： | 张梁;高芝;顾正华;李由然;丁重阳;石贵阳 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | C12N15/81 | 分类号： | C12N15/81;C12N15/66;C12R1/72 |
| 代理公司： | 32228 无锡华源专利商标事务所(普通合伙) | 代理人： | 聂启新 |
| 地址： | 214122 江苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明公开了一个Candida amazonensis的FLP/FRT基因敲除系统，属于基因工程技术领域。本发明将FLP重组酶基因置于严格诱导型启动子SpGAL1p或SpMAL1p下调控，并在FLP表达盒和抗性标记表达盒两端添加同向重复的FRT位点，以PDC为靶基因构建基因敲除盒整合到Candida amazonensis基因组中，后续通过添加诱导剂诱导FLP表达，实现抗性基因的切除。本发明首次实现了Candida amazonensis的无标记基因敲除，并可以用于连续敲除多个基因，为Candida amazonensis的代谢工程改造提供了强有力的技术手段。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 candidaamazonensis flp frt 基因 方法 | ||
【主权项】：
1.一种亚马逊假丝酵母(Candida amazonensis)的FLP/FRT基因敲除方法，其特征在于，包括构建基因敲除盒以及消除潮霉素抗性基因；所述潮霉素抗性基因的消除是指通过添加诱导剂诱导FLP酶表达，以切除FRT位点之间的FLP表达盒和潮霉素抗性基因表达盒；/n所述方法包括以下步骤：/n(1)构建基因敲除盒，敲除盒从5’-3’依次包括以下核心元件：靶基因上游同源臂、FRT位点、严格诱导型启动子SpGAL1p或SpMAL1p、caFLP重组酶基因、SpCyC1t终止子、潮霉素抗性基因hphm表达盒、FRT位点、靶基因下游同源臂；/n(2)用包含基因敲除盒的质粒转化Candida amazonensis，得到靶基因敲除的阳性克隆；/n(3)将阳性克隆接种于诱导培养基，诱导FLP重组酶基因表达，切除同向FRT位点之间的DNA片段。/n
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