[发明专利]一种基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法

摘要

本发明公开了一种基于DNA‑银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，首次将DNA‑银纳米簇分子信标这种新型纳米材料作为荧光探针应用于转录因子的检测。并且，基于DNA‑银纳米簇分子信标的荧光调节是由可以被酶切割的DNA片段这一特征，加入了核酸外切酶III，既参与了信号的转化，又参与了检测信号的增强。本发明中转录因子的检测方法具有免标记，选择性高，低成本，灵敏度高的优点，能够实现生物样品中转录因子的高通量检测。

主权项

1.一种基于DNA‑银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，其特征在于检测方法包括如下步骤：a)将单链DNA reporter与其互补单链s‑reporter在Tris‑Ac缓冲液中杂交形成双链探针dsNF‑κB p50 probe；在步骤a）之前，配置Tris‑Ac缓冲液，具体配方是10mM Tris‑Ac, 0.1mM EDTA, 100mM NaAc；b) 10μL，50nM的dsNF‑κB probe与体积都是5μL的30nM‑2500nM的转录因子NF‑κB p50的溶液混合，随后加入3μL，10U/μL的Exo III，在37℃下反应30min；反应缓冲体系：10mM Tris–Ac, pH7.5, 100mM KCl,2mM MgCl2, 0.1mM EDTA, 10%（v/v）glycerol，30min后，向上述反应体系中加入20μL，1μM的AgMBs，37℃下反应2h；c)测定样品在561nm激发波长下，620nm处的荧光值，利用测得的I620的值，获得转录因子浓度与荧光强度的线性关系；d）从实际细胞或组织样品中获得核蛋白提取物作为待测样品，根据步骤c)所得到的线性关系与待测样品获得的荧光强度，得到待测样品中转录因子的浓度；其中，Reporter：GAGGGGACTTTCCCAGCCCCACCCCACCCCACCCTCGTCATCAGATACTTAs‑reporter：ATCTGATGACGAGGGTGGGGTGGGGTGGGGCTGGGAAAGTCCCCTC制备AgMBs时所用的AgMBs模板的序列为：CCCTTAATCCCCTCGTCAATGCGATCTGATGACGAGGGTGGGGTGGGGTGGGG。