[发明专利]一种脂肪干细胞分离培养方法

摘要

本发明涉及脂肪干细胞分离培养领域，公开了一种牙髓干细胞分离培养方法，包括以下步骤洗涤脂肪组织，使用I型胶原酶消化脂肪组织，分离脂肪基质血管组分，再净化沉淀，将得到的原代细胞进行种植，并且培养，最终收获原代细胞，进行原代细胞传代。本发明通过规范牙髓干细胞分离培养的方法及具体操作中的各项参数，提高牙髓干细胞分离培养效率、产出率，降低生产成本。

主权项

一种脂肪干细胞分离培养方法，其特征在于，包括：S1，洗涤脂肪组织，除去血细胞，向T175培养瓶中加入50ml脂肪组织、100ml氯化钠注射液，拧紧盖子，剧烈晃动3min以充分洗涤脂肪组织，接着静止3～5min，使不同相分离，吸去下层水相，重复S1步骤三次，直到下层液较为清澈；S2，I型胶原酶消化，加入0.1％预热的I型胶原酶溶液，封口，剧烈晃动T175培养瓶5～10秒，置于振动气浴锅中，37℃，70rpm，消化60min，每隔15min剧烈晃动培养瓶5～10秒，直到脂肪组织看起来较为平滑；S3，分离脂肪基质血管组分，将消化后的脂肪组织用无菌40目滤网分装到50ml的离心管中，室温下400g离心10min，得到的沉淀即为脂肪基质血管组分；S4，净化沉淀，离心后，脂肪基质血管组分沉积于离心管底部，用移液管自上而下除去上层油脂和下层的胶原酶溶液，再加入适量生理盐水重悬细胞，吹散，室温400g离心10min，离心完毕，再次吸取上层清液，最后加入10ml培养基悬浮细胞，将细胞汇总到50ml离心管中，过100目筛，再次在室温下，300g离心10min；S5，细胞种植，离心后加20ml培养基充分混匀，按照每平方厘米接种0.16ml抽脂得到的脂肪量进行接种，即每个T75培养瓶中接种12ml抽脂脂肪量，每100ml脂肪组织，最终可以接种8个T75培养瓶，进行未处理脂肪量和最终得到的细胞悬液换算，进而接种细胞；S6，细胞培养，将T75培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱，原代培养第24h后，进行全量换液，此后每隔3天全量换液，并且保持在二氧化碳恒温恒湿培养箱进行培养；S7，原代细胞收获，7天左右，原代培养的细胞克隆团的面积百分比到达70％～80％时，收获原代细胞，在T75培养瓶中每75cm2加入2ml由125％Trypsin～0.01％EDTA组成的消化酶溶液，消化1.5～2.5min，再加入培养基2～3ml反复吹打瓶底至细胞大部分脱落,将脱落下来的原细胞移入50ml离心管中，并往原T75培养瓶中加入4～5ml氯化钠注射液冲洗瓶壁，最终加入50ml离心管中并定容至50ml，使用移液管吹打悬浮后，通过100目无菌滤网过滤，过滤液收集到另一个50ml离心管中，1000rpm，10min离心洗涤；S8，原代细胞传代，观察单个离心管内余下细胞沉淀量，适当合并数个离心管中细胞沉淀至1个离心管中，加入适量培养基，轻轻吹打重悬浮细胞，定容至30ml，吹打混匀，取样计数，计数后进行1000rpm，10min二次离心，去除上清液，在离心管中加入培养基适量，轻轻吹打重悬浮细胞，定容后接种至新的培养容器中，传代细胞密度为5000～6000个/cm2，即(3.75～4.5)×105个cells/T75，在培养容器上标示细胞代数与培养时间等信息，将培养容器放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱开始培养，直至培养至细胞融合达85％～90％。