[发明专利]孢子丝菌DRK1基因GFP报告菌株的构建方法

摘要

本发明涉及孢子丝菌DRK1基因GFP报告菌株的构建方法。提取孢子丝菌总DNA；克隆孢子丝菌SsDRK1基因加尾信号序列至p‑EGFP‑N1载体的gfp基因尾部，得p‑EGFP‑N1‑t；再克隆孢子丝菌SsDRK1基因启动子序列至p‑EGFP‑N1‑t的gfp基因前部，得重组质粒p‑EGFP‑N1‑p‑t；构建PCB309‑pSsDRK1‑yEGFP‑tSsDRK1重组质粒；将PCB309‑pSsDRK1‑yEGFP‑tSsDRK1重组质粒转化根癌农杆菌感受态细胞中，再转入孢子丝菌中。本发明以绿色荧光蛋白表达情况来示踪DRK1的表达水平，从而对DRK1基因的表达做到更加便捷、准确的监测。

主权项

孢子丝菌DRK1基因GFP报告菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：(一)提取孢子丝菌总DNA；(二)克隆孢子丝菌SsDRK1基因加尾信号序列至载体p‑EGFP‑N1的gfp基因尾部，制备重组质粒p‑EGFP‑N1‑t：2.1)以DNA为模板，以特异性引物Au和Ad进行PCR扩增，扩增具有孢子丝菌SsDRK1基因加尾信号序列的PCR产物；所述的特异性引物Au：gcggcggccgcTAGGGACAAGGACCTCCAC所述的特异性引物Ad：gcgtctagactagtGTAGTAAACAATCAAAACCAGTG所述的孢子丝菌SsDRK1基因加尾信号序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；2.2)将PCR产物和p‑EGFP‑N1载体分别用NotI和XbaI双酶切，将酶切回收的PCR产物和p‑EGFP‑N1连接；2.3)将连接产物转化大肠杆菌DH5a，获得重组质粒p‑EGFP‑N1‑t；(三)克隆孢子丝菌SsDRK1基因启动子序列至重组质粒p‑EGFP‑N1‑t的gfp基因前部，制备重组质粒p‑EGFP‑N1‑p‑t：3.1)以DNA为模板，以特异性引物Qu和Qd进行PCR扩增，扩增具有孢子丝菌SsDRK1基因启动子序列的PCR产物；所述的特异性引物Qu：gcggagctcGCGAATGGACAGAGGTAAGT所述的特异性引物Qd：gcgggatccTGTTGAAAGAGGGTAAACGGAG所述的孢子丝菌SsDRK1基因启动子序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；3.2)将PCR产物和p‑EGFP‑N1‑t分别用SacI和BamHI双酶切，将酶切回收的PCR产物和p‑EGFP‑N1‑t连接；3.3)将连接产物转化大肠杆菌DH5a，获得重组质粒p‑EGFP‑N1‑p‑t；(四)构建PCB309‑pSsDRK1‑yEGFP‑tSsDRK1重组质粒：通过SacI和speI双酶切重组质粒p‑EGFP‑N1‑p‑t和载体PCB309，将双酶切后的产物进行连接，构建PCB309‑pSsDRK1‑yEGFP‑tSsDRK1重组质粒；(五)构建孢子丝菌DRK1基因GFP报告菌株：将PCB309‑pSsDRK1‑yEGFP‑tSsDRK1重组质粒转化根癌农杆菌感受态细胞中，再将含有PCB309‑pSsDRK1‑yEGFP‑tSsDRK1的根癌农杆菌与孢子丝菌混合，将PCB309‑pSsDRK1‑yEGFP‑tSsDRK1转入孢子丝菌中，获得孢子丝菌DRK1基因GFP报告菌株。