[发明专利]一种检测HLA-A*31:01等位基因的MGB探针实时荧光PCR方法及其引物探针组合

摘要

本发明提出一种检测HLA‑A*31:01等位基因的MGB探针实时荧光PCR方法及其引物探针组合，在使用高特异性MGB探针检测法的基础上，同时结合ARMS(扩增阻滞突变系统)的方法，使检测HLA‑A*31:01等位基因的方法更具特异性。本发明设计的高特异性扩增HLA‑A*31:01等位基因的引物探针组合如下：上游引物Fp：5’‑GAGCCAGAGGATGGAGCC‑3’下游引物Rp:5’‑CCAGGTCCACTCGGTCtA‑3’探针probe1：5’‑FAM‑aGGCCtGAGTATTGGGAC‑MGB‑3’探针probe2:5’‑VIC‑CCTTCACaTTCCGTGTCTC‑MGB‑3’FAM为6‑carboxyfluorescein；VIC为4,7,2‑trichloro‑7‑phenyl‑6‑carboxyfluorescein；MGB为Minor Groove Binder；此外，使用内参基因ACTB的引物及探针，将目的基因的特异性引物、探针和内参基因的引物、探针加入同一管中进行多重荧光PCR反应，通过荧光扩增曲线分析结果。本发明具有简便、灵活快速、特异性高、高通量、无污染、灵敏度高、可实时监测反应等特点，可适用于人体外周血、唾液中全基因组DNA样本的HLA‑A*31:01等位基因的检测。

主权项

用于多重荧光PCR反应高特异性扩增HLA‑A*31:01等位基因的引物探针组合，其特征在于，包括以下目的基因的特异性引物和探针，其序列如下：上游引物Fp：5’‑GAGCCAGAGGATGGAGCC‑3’；下游引物Rp:5’‑CCAGGTCCACTCGGTCtA‑3’；该下游引物Rp序列的倒数第二位小写字母t表示的碱基为人为引入的错配，以增强检测的特异性，并且倒数第一位碱基A为HLA‑A*31系列等位基因所含有的特异性碱基；探针probe1：5’‑FAM‑aGGCCtGAGTATTGGGAC‑MGB‑3’；小写字母a、t表示的碱基为具有特异性的碱基；探针probe2:5’‑VIC‑CCTTCACaTTCCGTGTCTC‑MGB‑3’；小写字母a表示的碱基为能够区分HLA‑A*31:01等位基因和其它HLA‑A*31等位基因的特异性碱基；其中FAM为6‑carboxyfluorescein；VIC为4,7,2′‑trichloro‑7′‑phenyl‑6‑carboxyfluorescein；MGB为Minor Groove Binder；还包括针对内参基因设计的特异性引物和探针。