[发明专利]一种鉴定甜樱桃啤酒花矮化类病抗性的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鉴定甜樱桃啤酒花矮化类病抗性的方法，该方法主要通过以下步骤实现的（1）植物总RNA的提取及引物设计；（2）HSVd全长cDNA克隆及测序；（3）HSVd侵染性克隆的构建；（4）质粒接种及抗病性鉴定。本发明成功构建了甜樱桃HSVd的侵染性克隆，进行人工接种进行抗病性鉴定。本发明克服了田间多种病毒复合侵染症状不单一，类病毒毒源保存等技术难度，构建了高效引发甜樱桃类病毒病的人工接种鉴定方法。

主权项

一种鉴定甜樱桃啤酒花矮化类病抗性的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）植物总RNA的提取及引物设计：提取感病甜樱桃叶片总RNA， ‑80℃保存备用；（2）HSVd全长cDNA克隆及测序：以提取的总RNA为模板，反转录试剂盒中的随机引物进行RT‑PCR反转录，反应体系为20μL；以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增反应，R1和F1为引物；PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，用快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（康为） 回收目的片段，将回收的片段与pGEM‑T（Promega）载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液PCR筛选阳性质粒；（3）HSVd侵染性克隆的构建：将所得分离物序列与HSVd序列进行比较，对测序正确的菌株摇菌提取质粒；以提取的质粒为模板，以4个HSVd全长片段的HSVd‑F1/HSVd‑R1和HSVd‑F2/HSVd‑R2为引物，引物对HSVd‑F1/HSVd‑R1用于扩增第一个片段，引物对HSVd‑F2/HSVd‑R2用于扩增第二个片段，利用高保真酶分别进行PCR扩增获得HSVd全长片段，电泳后切胶回收；将两个片段与载体进行重组反应，反应结束后瞬时离心，将离心管置于冰上冷却5min；重组产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液PCR筛选阳性质粒；（4）质粒接种及抗病性鉴定：将获得含有HSVd cDNA加倍串联序列的克隆质粒pGEM‑HSVd‑HSVd，提取质粒pGEM‑HSVd‑HSVd，通过茎杆注射方法进行接种甜樱桃砧木G6，同时以接种空白质粒pGEM的植株为阴性对照。