[发明专利]一种动物全身性表达重组人溶菌酶的方法

摘要

一种动物全身性表达重组人溶菌酶的方法，其特征在于第一步人溶菌酶BAC克隆选择Genome Systems公司的GenBank号为RP11‑72P21作为目标hLZ BAC克隆；第二步冗余基因CPSF6的去除为避免冗余基因CPSF6对hLZ基因的干扰，通过重组方法去除冗余基因CPSF6，获得去除冗余基因的人溶菌酶pBAC‑hLZ‑Neo。本发明与已有技术相比，具有能在身体的多个部位都有表达的优点。各组织器官中表达的重组人溶菌酶均有生物活性；肠道中表达的重组人溶菌酶能极显著增加双歧杆菌的数量（P<0.001），同时极显著降低沙门氏菌的数量（P<0.001）。

主权项

一种动物全身性表达重组人溶菌酶的方法，其特征在于第一步：人溶菌酶BAC克隆选择Genome Systems公司的GenBank号为RP11‑72P21作为目标hLZ BAC克隆，该hLZ BAC克隆含有155kb 5’调控区—CPSF6冗余基因，4.8kb hLZ基因组序列和6kb 3’调控区；第二步：冗余基因CPSF6的去除：为避免冗余基因CPSF6对hLZ基因的干扰，通过重组方法去除冗余基因CPSF6，具体步骤如下：（1）hLZ BAC克隆通过电转染方法转入SW102菌株（该菌株已转入了Red重组系统所需要的exo蛋白、bet蛋白、gam蛋白）；SW102菌株是美国国立卫生研究院生物资源分部提供，（2）选择CPSF6冗余基因外显子1为重组置换区域，设计同源臂，以pBR322‑loxP‑Neo质粒设计引物扩增loxP‑Neo基因片段，同时将同源臂和引物连接，获得包含如下重组引物的PCR产物，F‑Neo：5’‑TCT CTG AGG ATG CAG AAA CAA GAC ATT GTT TTT GGT CAT ACG CCG TTC ACA GAA TGC CCG CCG CCT CCA TCC AGT CTA TT ‑3’；R‑Neo：5’‑TTA TCT GTG GCT CCA AAA GTC AAA GGA CTT GTT GCA AAT GAG CCC GCA CCT CAG TCG CCT GTC GCC GCA TAC ACT ATT CT‑3’，其中，CG CCT CCA TCC AGT CTA TT和GTC GCC GCA TAC ACT ATT CT为引物，其他为同源臂，（3）重组引物所得到的PCR产物，切胶回收后，电击转入含有含hLZ BAC的SW102菌株中，发生重组，获得去除冗余基因的人溶菌酶pBAC‑hLZ‑Neo。