[发明专利]一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法

摘要

本发明公开了一种用于检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法，通过由胸腺嘧啶DNA糖基化酶引发、酶修复辅助的循环滚环指数扩增和核酸内切酶Ⅳ催化介导的循环切割实现实时检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的荧光方法；由于尿嘧啶切除辅助的循环滚环扩增和基于核酸内切酶Ⅳ的循环切割效率都很高，且尿嘧啶介导的指数扩增能极大地抑制非特异性扩增，因此该方法的检测灵敏度很高，经检测，所述方法对胸腺嘧啶DNA糖基化酶的检测下限可达5.6×10‑7U/μL；同时，本发明利用胸腺嘧啶DNA糖基化酶和尿嘧啶DNA糖基化酶的自身修复特性，使整个修复反应严格按照自然修复机制进行，因此本方案的特异性很高。

主权项

一种基于循环酶修复介导的双信号放大策略检测胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)待测胸腺嘧啶DNA糖基化酶诱导的胸腺嘧啶切除修复：双链DNA底物中加入待测胸腺嘧啶DNA糖基化酶、核酸内切酶IV、尿嘧啶DNA糖基化酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧尿苷三磷酸和DNA聚合酶；所述双链DNA其中一条为环形模板DNA，另一条为线性探针，所述环形模板DNA与线性探针的部分序列杂交形成胸腺嘧啶DNA糖基化酶的双链DNA底物；杂交区域内线性探针上设计有且仅有一个错配的胸腺嘧啶；通过胸腺嘧啶DNA糖基化酶特异性地切割脱氧核糖和胸腺嘧啶之间的N‑糖苷键，从而剪切掉线性DNA探针上错配的胸腺嘧啶，产生一个脱碱基位点；然后核酸内切酶Ⅳ将对脱碱基位点进行剪切，从而导致线性探针3’端部分序列的断裂；(2)尿嘧啶切除辅助的循环滚环扩增：在脱氧腺苷三磷酸，脱氧鸟苷三磷酸，脱氧胞苷三磷酸和脱氧尿苷三磷酸和聚合酶存在条件下，被切断的线性探针作为引物引发滚环扩增反应，产生包含尿嘧啶核苷酸的长片段重复序列；而后在尿嘧啶DNA糖基化酶和核酸内切酶Ⅳ协助下，尿嘧啶被特异性切除，同时产生一个带羟基的3’末端以确保新的聚合延伸的循环；持续的聚合和尿嘧啶切除过程导致大量报告序列的生成；产生的报告序列随后与剩余的环形模板DNA结合以引发新一轮的聚合和尿嘧啶切除反应循环，最终生成大量报告序列；(3)核酸内切酶Ⅳ介导的信号探针循环切割以及荧光分子的释放：加入信号探针，所述信号探针为荧光标记探针，所述信号探针上设计有且仅有一个四氢呋喃的无嘧啶位点，所述信号探针与报告序列结合，引发核酸内切酶Ⅳ介导的信号探针上的四氢呋喃的无嘧啶位点的循环切割，最终产生放大的荧光信号，对荧光信号进行检测，定量分析胸腺嘧啶DNA糖基化酶活性。