[发明专利]一种动物角类药材角质层的DNA提取方法

摘要

本发明属于中药材鉴定技术领域，为解决现有动物角类药材DNA的提取方法存在角质细胞裂解不彻底，提取的DNA模板浓度低，DNA降解严重的角类药材无法进行PCR的问题，提供一种动物角类药材角质层的DNA提取方法。样品前处理、取样、DNA提取，提取的DNA样本进行PCR扩增，低浓度样品进行二次扩增。确定了取样量为25mg，DTT用量为20µl，角质细胞裂解完全，DNA质量可满足PCR要求。建立角类动物药材角质层的DNA提取方法，使提取的DNA质量满足常规PCR要求。建立的DNA提取方法，提取DNA完全，可标准化操作，可应用于多种动物角的提取。

主权项

一种动物角类药材角质层的DNA提取方法，包括样品前处理、取样、DNA提取，其特征在于：具体步骤为：（1）样品前处理：取收集到的动物角类药材样品，所述动物角类药材样品为个子样品，其处理方法为：先将样品用电锯切割横截面，将样品切割成片状，然后将片状样品用刀片刮去外层污染，取内层，削成细薄片；所述动物角类药材样品为块状样品，其处理方法为：用刀片刮去外层污染后，取内层，削成细薄片；所述动物角类药材样品为丝状样品，其处理方法为：用75%乙醇清洗3次，双蒸水冲洗至无醇味，紫外光下照射，晾干；消毒剪剪成碎片，备用；（2）取样：称取样品25‑70mg，加入DTT20‑100µl，Proteinase K 40µl及裂解缓冲液GA 400µl后，56℃金属浴酶解3‑4小时后提取DNA；（3）DNA提取：按试剂盒提取步骤提取DNA，Nano Drop 2000测定DNA的浓度及纯度；（4）提取的DNA样本进行PCR扩增：扩增引物为CO1基因的通用引物，正向引物LCO1490 5′‑ggTCAACAAATCATAAAgATATTgg‑3′反向引物HCO2198 5′‑TAAACTTCAgggTgACCAAAAAATCA‑3′，25µl反应体系，模板用量为150~180ng；低于150~180ng时，模板取样定为10µl；浓度为10mmol/L的正向、反向引物各1µl；2×EasyTag SuperMix 12.5µl；双蒸水补足至25µl；PCR扩增程序为：94℃1min；94℃，1min，45℃，1.5min，72℃，1.5 min，5个循环；94℃，1min，50℃，1.5min，72℃，1min，35个循环；72℃，5min；用含有GoldView I 型核酸染色剂的1.5%琼脂糖凝胶点样，DL 2，000 DNA Marker 为对照，样品5µl与2µl 6×Loading Buffer 混合均匀点样，TBE缓冲液中电泳，凝胶成像仪成像；割取750bp处的DNA条带，胶回收纯化PCR产物，测序；（5）低浓度样品进行二次扩增：样品浓度为10~14ng/µl，不能测序时，进行二次扩增：提取的DNA第一次扩增后，紫外灯下割取750bp处的条带，切成碎块，100µl双蒸水溶解，60℃温育，模板用量5µl，进行二次扩增；浓度为10mmol/L的正向、反向引物各1µl；2×EasyTag SuperMix 12.5µl；双蒸水补足至25µl；扩增程序为95℃1min，40℃，1min，72℃，1.5min，72℃，1.5 min，35个循环模，72℃，保存7min；1.5%琼脂糖点样，TBE缓冲液电泳，凝胶成像仪成像，割取750bp处的DNA条带，胶回收纯化PCR产物，测序。