[发明专利]重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法

摘要

本发明公开了重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，它包括以下步骤：①、制备标准品溶液；②、制备供试品溶液；③、测定吸光度，记录测定结果，试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，计算供试品的生物学活性。本发明提供的重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，操作简便，容易观察，且具有良好的线性关系，重复性好，特异性强，为监控其产品质量提供了一种行之有效的技术手段。

主权项

1.重组人白细胞介素1受体拮抗剂滴眼液生物学活性的检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：①、制备标准品溶液；所述标准品溶液制备方法为：将rhIL‑1ra标准品10μg用1.25ml水溶解，然后用培养液B₂稀释10倍，使其浓度为800ng/ml，在培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做2孔或3孔，每孔分别留50μl标准品溶液，弃去孔中多余溶液；所述培养液B₂是培养液A加入rhIL‑1β至1ng/ml，所述培养液A为含10％新生牛血清的DMEM培养液；所述rhIL‑1ra标准品的比活性为1U/mg；所述rhIL‑1β的比活性≥1×10⁷U/mg；②、制备供试品溶液；所述供试品溶液是由以下方法制成：取rhIL‑1ra滴眼液，加培养液B₂，至rhIL‑1ra浓度为800ng/ml，在培养板中，做3倍系列稀释，共11个稀释度，每个稀释度做2孔或3孔，每孔分别留50μl供试品溶液，弃去孔中多余溶液；所述培养液B₂是培养液A加入rhIL‑1β至1ng/ml，所述培养液A为含10％新生牛血清的DMEM培养液；所述rhIL‑1ra滴眼液是由以下方法制成：rhIL‑1ra50mg、人血白蛋白1g、甘露醇60g、氯化钠70g、氯化钾2g、磷酸氢二钠14.4g、磷酸二氢钾2.4g，加水，配制成1000ml的溶液；③、在加有标准品溶液和供试品溶液的培养板中，每孔加入A375‑s2细胞悬液100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养96小时～108小时；每孔用Hank's液洗细胞1次，加50μl无血清DMEM，每孔再加入20μl噻唑蓝溶液，继续培养5小时；取出培养板，吸出培养液，然后加入150μl裂解液，吹打以充分溶解还原物；所述A375‑s2细胞悬液的细胞浓度为6×10⁴个/ml～7×10⁴个/ml；所述裂解液是由以下方法制成：取1ml盐酸、5ml Triton X‑100，加异丙醇，配制成100ml的溶液；所述的盐酸含HCl为36％～38％；将培养板放入酶标仪，以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果；试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按下式计算供试品的生物学活性：式中，P_r为标准品的生物学活性，U/ml；D_s为供试品预稀释倍数；D_r为标准品预稀释倍数；E_s为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；E_r为标准品半效量的稀释倍数。