[发明专利]一种脱细胞基质材料中纤维连接蛋白的定量检测方法及应用有效
| 申请号： | 201710214434.5 | 申请日： | 2017-04-01 |
| 公开（公告）号： | CN107064522B | 公开（公告）日： | 2018-11-20 |
| 发明（设计）人： | 赵博;张贵锋;陈毅;夏磊磊;赵延瑞;张扬 | 申请（专利权）人： | 北京博辉瑞进生物科技有限公司 |
| 主分类号： | G01N33/68 | 分类号： | G01N33/68;G01N30/02;G01N30/72 |
| 代理公司： | 北京中政联科专利代理事务所(普通合伙) 11489 | 代理人： | 陈超 |
| 地址： | 102600 北京市大兴区中关村科技园区*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | 本发明提供一种脱细胞基质材料中纤维连接蛋白的定量检测方法及应用。所述定量检测方法包括对脱细胞基质的预处理、分步酶解方法和质谱检测过程，通过脱细胞基质的预处理、分步酶解方法获得纤维连接蛋白的所有多肽序列混合物，再筛选纤维连接蛋白中的特征多肽序列，通过质谱法检测特征多肽含量，从而测定出脱细胞基质中纤维连接蛋白含量。该方法解决了以往无法使用质谱法定量检测脱细胞基质中组织型纤维连接蛋白含量的问题；进一步地，通过分步酶解的方式去除脱细胞基质中胶原蛋白成分、减少测试过程非目标蛋白多肽序列的干扰，从而节约了测试时间，提高工作效率、检测精度和稳定性。 | ||
| 搜索关键词： | 脱细胞基质 定量检测 纤维连接蛋白 多肽序列 连接蛋白 中纤维 酶解 预处理 质谱法检测 测试过程 工作效率 胶原蛋白 目标蛋白 细胞基质 质谱检测 混合物 质谱法 多肽 去除 应用 筛选 测试 检测 节约 | ||
【主权项】：
1.一种检测脱细胞基质中纤维连接蛋白含量的方法，其特征在于，该检测方法包括以下步骤：(1)预处理：称取一定重量的脱细胞基质，将其剪成尺寸小于1cm×1cm的小片，在液氮保护条件下粉碎成粉末，粉末尺寸控制在50‑300μm；(2)酶解1：取一定量粉碎后脱细胞基质粉末，加入到脱细胞基质粉末重量500‑10000倍的缓冲液，在100℃热处理5‑10min，冷却后加入脱细胞基质重量1/200～1/50的胶原酶，于37℃振荡处理2‑24h；(3)酶解2：将步骤(2)获得的溶液pH调节至7.5‑8.5，加入非胶原类蛋白酶，非胶原类蛋白酶的加入量为脱细胞基质重量的1/200～1/50，于37℃反应8‑24h；(4)质谱检测：将步骤(3)获得的酶解溶液进行浓缩，浓缩液直接进行质谱分析，以已知浓度的纤维连接蛋白标准品溶液的酶解产物为对照，检测特征多肽，通过测定脱细胞基质降解产物中纤维连接蛋白特征多肽计算脱细胞基质中纤维连接蛋白的含量。
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