[发明专利]一种纸基灵敏检测miRNA的方法

摘要

本发明公开了一种纸基灵敏检测miRNA的方法，更确切的说采用特异性双链核酸酶在纸芯片上构建了miRNA的信号放大机制，通过固定在纸芯片上的纳米金电极上的金与亚甲基蓝标签标记巯基修饰的DNA发夹探针SH‑CP‑21上的巯基形成金‑硫键，将此发夹探针自组装在纸芯片上，并用巯基乙醇有在纸芯片上表面阻挡此发夹探针，随后由于目标miRNA和固定在纸芯片上的发夹探针之间的杂交导致RNA / DNA双链体的形成，并且双链特异性核酸酶会切割RNA / DNA双链体中标记的发夹探针，切割后带有标记发夹探针又会与目标miRNA杂交导致RNA / DNA双链体的形成，照此循环，由于标记的发夹探针被切割，再用电化学方法检测的电流与没切割之前检测的电流有很大差距，从而提高检测的灵敏度，降低检测成本。

主权项

一种纸基灵敏检测miRNA的方法，其特征是包括以下步骤：（1）制备所需要的试剂焦炭酸二乙酯处理水成分是1 L 无菌水、1000 µL 焦炭酸二乙酯，经摇床过夜、次日高温高压灭菌30 min 得到；生长溶液是由667 µL 质量分数为1% 的氯金酸、1000 µL 焦炭酸二乙酯处理水、0.0139 g 盐酸羟胺组成；400 mL 探针DNA缓冲溶液成分是1.0412 g 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸、24.5 g 高氯酸钠，经焦炭酸二乙酯处理水稀释，浓盐酸调节PH到7得到；（2）纳米金修饰纸芯片将纳米金溶液滴加至纸芯片的工作区域，待其自然干燥后，重复滴加两次，将生长溶液滴加至纸芯片的工作区域，待其自然干燥后，重复滴加两次；（3）巯基和纳米金形成金‑硫键纸芯片上滴加5 µL 10 nM 用亚甲基蓝标签标记巯基修饰的DNA发夹探针SH‑CP‑21，在黑暗环境下室温放置2 h，然后用20 µL 一倍的磷酸盐缓冲盐水洗，自然晾干；（4）巯基乙醇的表面阻挡纸芯片上滴加8 µL 巯基己醇自然晾干，最后用20 µL 一倍的磷酸盐缓冲盐水洗，自然晾干；（5）放大和复用过程取一定量的50 fM 目标分子miRNA‑21、特异性双链核酸酶和特异性双链核酸酶缓冲液，使总体积为7 µL，搅拌离心混匀后滴加至纸芯片工作区域，孵育2 h；（6）检测过程将纸芯片置于适量探针DNA缓冲溶液中，用方波伏安法检测；方波伏安法检测的实验参数如下：初始电压为‑0.5 V、终止电压为0.5 V、电位增量为0.004 V、振幅为0.025 V、频率为25赫兹、静置时间为2 S、灵敏度为10‑6 A/V。