[发明专利]一种活性多肽SPGP‑V的制备方法

摘要

本发明公开了一种制备新型生物活性多肽的方法，得到的这种新型生物活性多肽，名称为蜘蛛抑钙肽‑V（SPGP‑V），是通过阳离子交换HPLC以及两步反相HPLC共三步分离获得，是从广西捕鸟蛛毒液中分离鉴定到的一种新型神经毒素，其一级结构由35个氨基酸残基组成，其中含6个半胱氨酸并形成三对二硫键。分子量为4111.7 Da，该多肽纯化冻干粉的理化性状为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明。

主权项

一种从广西捕鸟蛛粗毒中制备新型生物活性多肽蜘蛛抑钙肽‑V（SPGP‑V）的方法，其特征在于，所述方法包括：（1）将粗毒干粉用双蒸水溶解配成10mg/mL的毒素溶液，12 000rpm离心5 min,置于4℃保存；粗毒上样阳离子交换HPLC进行第一步分离；采用预装柱进行分离；486检测器检测，检测波长为 215nm；流动相为四相洗脱系统，流速为3 mL/min；洗脱液分别为A相0.1M磷酸二氢钠, B相0.1M 磷酸氢二钠, C相 1M氯化钠, D相双蒸水（ddH2O）；其中A液和B液用来调节洗脱液的pH值，采用氯化钠梯度洗脱；上述经阳离子交换 HPLC分离后收集的各洗脱峰分别上样反相HPLC进行进一步纯化；反相高效液相色谱分离脱盐纯化：在Pharmacia公司的AKTA蛋白纯化系统上完成，采用大连依利特公司的C18反相制备柱；第三步分析型Waters 2690 高效液相色谱仪上进行梯度洗脱，采用分析型Vydac C18 RP‑HPLC反相柱 (218TP54, 4.6×250 mm) 于996检测器检测，检测波长为280nm，流动相为含0.1%TFA的水（A）和乙腈（B），洗脱速度为1mL/min，柱温为40℃；（2）通过上述阳离子交换HPLC以及两步反相HPLC共三步分离获得的SPGP‑V，运用质谱鉴定纯度达到98%以上，其分子量约为4111.7 Da，经序列测定，该多肽的一级结构由35个氨基酸残基组成，其中含6个半胱氨酸并形成三对二硫键，C‑端未酰胺化；多肽SPGP‑V纯化冻干粉的理化性状为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明。