[发明专利]一种根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化方法，属于遗传转化领域。本发明利用根癌农杆菌介导的转化方法，操作简单，转化率高并且转化稳定，成功实现了意大利青霉的高效遗传转化，使得意大利青霉中进行同源敲除、过表达、异源表达成为可能，为基因工程手段对该菌株进行遗传改良，探究其侵染柑橘的致病机理奠定基础。

主权项

1.一种根癌农杆菌介导的意大利青霉遗传转化方法，其特征在于包括以下步骤：1)以潮霉素B抗性基因作为筛选标记，以pacC基因的上、下游序列作为同源臂，敲除意大利青霉(penicillium italicum)pacC基因，利用质粒pCAMBIA3300构建含有潮霉素B抗性基因的基因敲除载体pacC3300；2)将步骤1)的基因敲除载体pacC3300转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感受态细胞，得到含有敲除载体的根癌农杆菌；3)将含有敲除载体的根癌农杆菌在含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基上扩大培养至OD600为0.8，然后再转入含有诱导剂的IM培养基培养至OD600为0.5，得到根癌农杆菌菌液；4)将萌发的意大利青霉制成浓度为1x10⁵cfu/mL的孢子悬浮液；5)将步骤3)的根癌农杆菌菌液与步骤4)的意大利青霉孢子悬浮液按1:1的体积比混合，在带有承载膜的Co‑IM固体培养基上共培养，培养温度25℃，培养时间36h‑48h，最后转入含有50ug/ml的潮霉素B和200ug/ml的头孢霉素的PDA培养基中进行抗性培养，筛选获得转化子，所述pacC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述潮霉素B抗性基因如SEQ ID NO:2所示。