[发明专利]一种鉴别蒙古黄芪和膜荚黄芪的方法

摘要

本发明涉及一种鉴别蒙古黄芪和膜荚黄芪的方法，本发明的目的是解决现有的蒙古黄芪和膜荚黄芪鉴别方法专属性低、难以鉴别黄芪种属的技术问题；本发明的技术方案是对黄芪药材干燥、粉碎；水提醇沉的方法提取黄芪多糖；制备黄芪多糖部分酸水解产物；水解产物的衍生化；对黄芪多糖水解产物进行电泳分析；经Quantity One对电泳图像处理，计算黄芪多糖中三糖和二糖的含量，并根据以下标准鉴别蒙古黄芪和膜荚黄芪当二糖含量＜1.0mg/mL，且二糖含量/三糖含量＜0.3时，为蒙古黄芪；当二糖含量＞1.0mg/mL，且二糖含量/三糖含量＞0.3时，为膜荚黄芪；本发明不仅操作简便、实验成本低，而且不同种属的黄芪多糖部分酸水解后形成的糖组分差异明显，可用于黄芪药材种属的鉴别。

主权项

一种鉴别蒙古黄芪和膜荚黄芪的方法，其特征在于，包括如下步骤：1)原料预处理：将干燥的黄芪粉碎成粉末后过100目筛得到黄芪细粉，备用；2)提取粗多糖：取上述黄芪细粉加水后在100℃的温度下回流提取1h，降至室温后离心取上清液；残渣再加水重复提取1次，取上清，合并上清液；浓缩，将合并的上清液用95％的乙醇调节至含醇量为80％，3000r/min离心10min，合并沉淀，冷冻干燥得多糖粗粉；3)纯化多糖：将步骤2)得到的多糖粗粉溶于水中，得到多糖粗粉溶液，所述多糖粗粉与水的质量比为1:200，向多糖粗粉溶液中加入浓度为10.6％的亚铁氰化钾溶液和浓度为21.9％的乙酸锌溶液，所述浓度为10.6％的亚铁氰化钾溶液和浓度为21.9％的乙酸锌溶液的加入量均为多糖粗粉溶液体积的10％，振摇后静置30min，离心得到纯化多糖，冻干，备用；4)多糖酸水解：取步骤3)得到的纯化多糖10mg，加入0.5mol/L三氟乙酸500μL，混匀，随后将混合液置于90℃保温1h，反应结束后，用氮吹干燥仪干燥多糖酸水解产物，然后加入适量甲醇清洗水解产物，继续氮气吹干；5)多糖酸水解产物、三糖标准品和二糖标准品的衍生化：取三糖标准品6mg、二糖标准品2mg以及步骤4)中得到的多糖酸水解产物，分别加入200μL的NaCNBH3溶液，再分别加入200μL的ANTS衍生化试剂，涡旋，混匀；37℃恒温反应15h后，将三种产物用氮气吹干，溶于1mL6mol/L的尿素溶液，制成三糖标准品、二糖标准品及多糖酸水解产物的衍生化样品，其中三糖标准品和二糖标准品的衍生化样品用6mol/L的尿素溶液分别稀释成不少于6个浓度梯度的衍生化样品；6)衍生化样品电泳分析：取步骤5)中多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和二糖标准品衍生化样品，采用垂直板凝胶电泳分离每个衍生化样品，分离胶为浓度为30％的聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶为浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶，电泳缓冲液为pH8.0‑9.0、浓度0.1‑0.2mol/L的Tris‑boric，上样量为1‑3μL，凝胶在UV300nm条件下成像，获得多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和二糖标准品衍生化样品的电泳图；7)绘制三糖标准品和二糖标准品的标准曲线：将多糖酸水解产物衍生化样品、三糖标准品衍生化样品和二糖标准品衍生化样品的电泳图导入Quantity One软件，经过处理后，得到多糖酸水解产物及三糖标准品和二糖标准品的光密度值，以三糖标准品和二糖标准品的光密度值为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；8)蒙古黄芪和膜荚黄芪的鉴别：将多糖酸水解产物的光密度值带入步骤7)中的标准曲线，计算黄芪多糖中三糖和二糖的含量，并根据以下标准鉴别蒙古黄芪和膜荚黄芪：当二糖含量＜1.0mg/mL，且二糖含量/三糖含量＜0.3时，为蒙古黄芪；当二糖含量＞1.0mg/mL，且二糖含量/三糖含量＞0.3时，为膜荚黄芪。