[发明专利]用于怀牛膝根系基因组DNA甲基化分析的DNA提取方法

摘要

本发明涉及一种用于怀牛膝根系基因组DNA甲基化分析的DNA提取方法。本发明基于CTAB法主要进行以下改进，CTAB、PVP、NaCl的浓度分别提高至4%、5%、2mol/L，同时添加1%SDS，并以氯仿与异戊醇混合液为抽提液，且裂解和抽提步骤的离心温度控制为25～35℃，再以无水乙醇沉淀DNA，并加高盐溶液离析多糖等杂质，再次沉淀DNA。本发明方法提取的怀牛膝根系DNA纯度高，酶切完全，甲基化基因筛选的多态性高、重复性好，提取获得的DNA可有效地应用于怀牛膝根系基因组DNA甲基化分析，为从表观遗观学水平研究怀牛膝生长发育、逆境胁迫、药效成分的积累等过程中的分子调控机制奠定物质基础。

主权项

一种用于怀牛膝根系基因组DNA甲基化分析的DNA提取方法，包括如下步骤：（1）取新鲜根系样品0.5～1g放入研钵中，迅速加入液氮，研磨充分后，移入离心管中，加入1.6～2.0ml的4%的CTAB提取液后，再加入60µl的β‑巯基乙醇后，盖紧离心管，轻弹并震荡匀浆后，放入65℃水浴锅中加热0.5～1.5小时，在此期间，每隔3～6分钟轻微颠倒1次，加热之后在25～35℃下10000～15000 rpm转离心15～20分钟；（2）吸取上步所得上清液，移入另一离心管中，并按上清液体积的1/3加入抽提液，轻轻上下颠倒混匀后，室温静置4～6分钟，在25～35℃下，10000～15000rpm转速离心8～12分钟；重复该步骤1～2次；（3）吸取上步所得上清液，移入另一新的离心管中，并按该上清液体积的1/4加入氯仿，轻轻上下颠倒混匀后，室温静置4～6分钟，在25～35℃下10000～15000rpm转速离心8～12分钟；（4）吸取上步所得上清液450～550 µl，移入另一新的离心管中，加入0.8～1.2ml‑20℃下预冷的无水乙醇，轻轻上下颠倒混匀后，于‑20℃下沉淀30～60分钟后，在4℃下10000～15000 rpm离心15～20分钟，去除上层溶液，得沉淀DNA；（5）向步骤（4）所得沉淀DNA中加入450～550µl的高盐溶液，65℃的水浴锅中孵育25～35分钟，4℃下10000～15000rpm转速离心8～12分钟；重复步骤（2）至步骤（4）；（6）加入0.8～1.2ml的75%乙醇，轻轻颠倒混匀洗涤DNA，在4℃下10000～15000rpm转离心4～6分钟；重复洗涤3～4次后，再用0.8～1.2 ml无水乙醇的洗涤1次后，将离心管平放在滤纸上晾干，加入30µl无菌的ddH2O溶解DNA；（7）加入1ul的 RNase 后，在37℃的水浴锅中孵育2小时，放入‑80℃冰箱备用。