[发明专利]一种分选白细胞的免疫磁珠的制备方法及储存方法

摘要

本发明公开了一种分选白细胞的免疫磁珠的制备方法及储存方法，具体步骤如下合成油酸‑Fe3O4；Fe3O4/PVAc磁性微球制备；(Fe3O4/PVA)/SiO2磁性微球的制备；将0.4ml 3‑氨丙基三乙氧基硅烷滴加到磁性微球(Fe3O4/PVA)/SiO2的乙醇悬浮液中，室温下搅拌7h氨基化，利用外加磁场从反应介质中分离出，并用乙醇溶液对其清洗五次备用；将氨基化的磁性纳米颗粒加入到50ml3％戊二醛的PBS溶液中，37℃下搅拌3h，通过氨基与醛基之间形成的Schiff碱在磁性颗粒表面修饰上醛基官能团，反应结束后利用外加磁场从反应介质中分离出颗粒，用PBS溶液反复冲洗产物，将颗粒分散在PBS溶液中，终浓度为8μg/μl；抗体的肼基化修饰；免疫磁珠的制备，储存方法为置于4℃下保存。本发明具有稳定性好、特异性强等优点。

主权项

一种分选白细胞的免疫磁珠的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：一、合成油酸‑Fe3O4(1.1)、在通氮气的条件下，将FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O溶解于800ml蒸馏水中，加热回流，加热至90℃时，在机械搅拌的同时，把346ml NaOH溶液加入以上溶液中；(1.2)、加入20ml油酸，90℃条件下，搅拌1小时后停止反应；(1.3)、待溶液冷却至室温后,外加磁场吸附出沉淀，然后用蒸馏水清洗1‑7次，产物即为油酸‑Fe3O4；二、Fe3O4/PVAc磁性微球制备(2.1)、向安装有搅拌器、冷凝管、温度计及导气管的四口烧瓶中加入100ml水，水浴加热回流，通入氮气脱气20min；(2.2)、加入表面活性剂和助表面活性剂，搅拌使充分混匀；(2.3)、加入10ml含有0.4g油酸‑Fe3O4纳米颗粒的醋酸乙烯酯混合溶液，搅拌使充分混匀；(2.4)、温度均匀上升，在45‑60℃的范围内停留30‑120min，当反应体系温度升高到80℃，加入过氧化苯甲酰0.5g，恒温反应8h，随着反应的进行，液体颜色有黑色变为红棕色；(2.5)、反应结束后，利用外加磁场将产物从溶液中分离出来，即将Fe3O4/PVAc从溶液中分离出来，用无水乙醇溶液清洗3次，并且分散在200ml无水乙醇溶液中；三、(Fe3O4/PVA)/SiO2磁性微球的制备(3.1)、将以上所得颗粒分散在200ml乙醇和水混合液中，将以上混合溶液超声10min，使其均匀分散；(3.2)、根据选择生成的SiO2壳的厚度，向溶液中加入正硅酸乙酯，然后搅拌30min；(3.3)、加入7ml NaOH溶液，室温下搅拌3h，最后利用外加磁场将终产物分离，再用乙醇清洗三次后，再分散在无水乙醇中；四、磁性颗粒的氨基化修饰将0.4ml 3‑氨丙基三乙氧基硅烷滴加到磁性微球(Fe3O4/PVA)/SiO2的乙醇悬浮液中，室温下搅拌7h氨基化，利用外加磁场从反应介质中分离出，并用乙醇溶液对其清洗五次备用；五、磁性颗粒的醛基化修饰将氨基化的磁性纳米颗粒加入到50ml3％戊二醛的PBS溶液中，37℃下搅拌3h，通过氨基与醛基之间形成的Schiff碱在磁性颗粒表面修饰上醛基官能团，反应结束后利用外加磁场从反应介质中分离出颗粒，用PBS溶液反复冲洗产物，将颗粒分散在PBS溶液中，终浓度为8μg/μl；六、抗体的肼基化修饰将5μL含对‑丙腙基吡啶甲酸N‑羟基琥珀酰亚胺脂的二甲基甲酰胺溶液加入到100μLCD45抗体溶液中，室温反应2h后，用超滤柱纯化得到肼基修饰的CD45抗体；七、免疫磁珠的制备将1mg醛基修饰的磁性微球与0.01mg肼基修饰的CD45抗体混合，在4‑25℃下PH值6.0的PBS缓冲液中混合2h‑24h,在磁分离作用下得到CD45抗体偶联磁性微球的CD45抗体免疫磁珠。