[发明专利]一种屏障加强的体外重组表皮模型的构建方法

摘要

本发明提供一种屏障加强的体外重组表皮模型的构建方法，涉及组织工程技术领域，能够从化学组成及物理结构两方面加强组织工程重建表皮模型的屏障功能，满足皮肤吸收和渗透试验要求，扩大了产品的应用范围。该方法包括：步骤一、表皮干细胞分离和培养：步骤二、组织工程表皮构建，以形成具有形态分化完全的基底层、棘层、颗粒层、角质层的组织工程表皮模型。

主权项

一种屏障加强的体外重组表皮模型的构建方法，其特征在于，该方法包括如下几个步骤：步骤一、表皮干细胞分离和培养：将人体皮肤组织置于培养皿中，加入75%酒精10mL，迅速进行冲洗，转入PBS溶液中，用剪刀剥离去除皮下疏松结缔组织，用PBS浸洗，将组织块切成0.3cm×0.5cm的大小，加入15ml质量比为1%的Dispase消化液，4℃消化过夜，分离真皮、表皮，收集表皮皮片，剪为碎块，再加入10ml质量比为0.025%的EDTA‑胰酶消化液，37℃消化10分钟，获得分离成单个细胞的表皮细胞溶液，用200目不锈钢筛网过滤表皮碎片，1000rpm离心7分钟，去掉上层清液，用PBS洗涤下层细胞，然后1000rpm离心7分钟，倒掉上清液，加入表皮细胞培养液，按2～4×106/瓶接种到IV型胶原包被的培养瓶中，37℃，5% CO2培养箱中孵育10～15min，吸出培养基，更换新鲜表皮细胞培养液继续培养，隔48h换一次液；步骤二、组织工程表皮构建：将步骤一中获得的表皮干细胞用胰酶消化液消化，用表皮细胞TU培养液制成密度为1×106～6×106个/ml的表皮干细胞分散液，取200μl接种于含有聚碳酸酯滤膜的细胞培养小室中，震荡均匀，在37℃，5% CO2培养箱中孵育20～30min；将接种后的细胞培养小室转入表皮模型培养模具中，小室外的培养皿中加入新鲜表皮细胞TU培养液，37℃，5% CO2培养箱继续培养24～48h后，吸去细胞小室中的剩余培养基，将细胞培养小室升至气液面，更换表皮细胞TA培养液，37℃ 5% CO2培养箱继续培养12～14天后可得具有形态分化完全的基底层、棘层、颗粒层、角质层的组织工程表皮模型。