[发明专利]一种天然利那洛肽的结晶方法有效
申请号: | 201710506214.X | 申请日: | 2017-06-28 |
公开(公告)号: | CN107163105B | 公开(公告)日: | 2020-12-11 |
发明(设计)人: | 刘磊;陈晨晨;高帅;李宜明 | 申请(专利权)人: | 清华大学 |
主分类号: | C07K7/08 | 分类号: | C07K7/08;C07K1/30;C07K1/06;C07K1/04 |
代理公司: | 北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙) 11201 | 代理人: | 罗文群 |
地址: | 100084*** | 国省代码: | 北京;11 |
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摘要: | 本发明涉及一种天然利那洛肽的结晶方法,属于药物制备技术领域。包括:以树脂作为固相载体,依照固相多肽合成的方法依次缩合具有N‑芴甲氧羰基(Fmoc)保护的D型氨基酸;待氨基酸缩合结束后,使用切割液进行侧链保护基团的脱除以及多肽与树脂的分离,通过乙醚沉淀切割液得到镜像利那洛肽的粗肽,再通过高效液相色谱分离、冻干,得到纯化后的还原态利那洛肽;最后,通过复性折叠实现二硫键的正确配对,即可得到具有正确空间构型的镜像利那洛肽;添加等浓度的镜像利那洛肽至天然利那洛肽的中性缓冲液中,充分混匀后,通过运用蛋白结晶筛选方法,采用不同的结晶溶液、特定温度及时间,实现镜像利那洛肽辅助天然利那洛肽的结晶。 | ||
搜索关键词: | 一种 天然 结晶 方法 | ||
【主权项】:
一种天然利那洛肽的结晶方法,其特征在于该方法包括以下步骤:(1)制备镜像利那洛肽,包括以下步骤:(1‑1)在树脂中加入N,N‑二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升,使树脂溶胀,加入溶液的体积比为:N,N‑二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液=1:1,溶胀时间为10分钟,利用隔膜泵作为动力源,将溶胀后的产物抽干,得到溶胀好的树脂;(1‑2)以步骤(1‑1)中树脂作为1倍量,将4倍量的N‑芴甲氧羰基‑O‑叔丁基‑D‑酪氨酸溶于5毫升的N,N‑二甲基甲酰胺溶液中,在该溶液中加入8倍量的N,N‑二异丙基乙胺,充分混匀后加入到步骤(1‑1)溶胀好的树脂中,室温反应2小时后加入2毫升甲醇,反应30分钟,利用隔膜泵作为动力源,抽干反应液,得到第一反应物;分别先后用N,N‑二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N‑二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次,在冲洗后的第一反应物中加入含有20%哌啶的N,N‑二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行N‑芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用N,N‑二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N‑二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到C端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物;(1‑3)将4倍量的N‑芴甲氧羰基‑S‑三苯甲基‑D‑半胱氨酸溶于5毫升的N,N‑二甲基甲酰胺溶液中,再加入3.6倍量的2‑(7‑偶氮苯并三氮唑)‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸酯和8倍量的N,N‑二异丙基乙胺,充分混匀,得到混合液,将该混合液加入到上述步骤(1‑2)的第二反应物中,室温下反应1小时,得到第三反应物,利用隔膜泵作为动力源,抽干第三反应物,分别用N,N‑二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N‑二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次,在第三反应物中加入含有20%哌啶的N,N‑二甲基甲酰胺溶液反应10分钟,进行N‑芴甲氧羰基的脱除,之后再分别先后用N,N‑二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N‑二甲基甲酰胺冲洗各五次,得到C端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物;(1‑4)根据利那洛肽的氨基酸序列,重复步骤(1‑3),将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物,得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂,记为第五反应物,所述的氨基酸的顺序为:N‑芴甲氧羰酰基‑甘氨酸、N‑芴甲氧羰基‑O‑叔丁基‑D‑苏氨酸、N‑芴甲氧羰基‑S‑三苯甲基‑D‑半胱氨酸、N‑芴甲氧羰酰基‑D‑丙氨酸、N‑芴甲氧羰基‑D‑脯氨酸、N‑芴甲氧羰基‑N'‑三苯甲基‑D‑天冬酰胺、N‑芴甲氧羰基‑S‑三苯甲基‑D‑半胱氨酸、N‑芴甲氧羰基‑S‑三苯甲基‑D‑半胱氨酸、N‑芴甲氧羰基‑O‑叔丁基‑D‑酪氨酸、N‑芴甲氧羰基‑D‑谷氨酸gamma‑叔丁酯、N‑芴甲氧羰基‑S‑三苯甲基‑D‑半胱氨酸和N‑芴甲氧羰基‑S‑三苯甲基‑D‑半胱氨酸;(1‑5)向步骤(1‑4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液,室温下反应2小时,然后将切割液转移至离心管中,利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩,最后待切割液浓缩至3毫升以内后,加入冰乙醚,离心后得到固体粗肽;(1‑6)使用半制备型高效液相色谱,将上述步骤(1‑5)得到的固体粗肽进行纯化,收集纯化后的溶液,并冻干,得到还原态镜像利那洛肽;(1‑7)将上述步骤(1‑6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中,使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升,25℃下复性过夜,待复性结束后,加入三氟乙酸调pH值至2.0后冻干,最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化,得到镜像利那洛肽;(2)称取相同质量的天然利那洛肽和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于pH值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中,使天然镜像利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为5‑40毫克/毫升;(3)在上述步骤(2)的溶液中加入结晶溶液,利用蛋白结晶筛选方法,在温度为4℃‑18℃,结晶时间为1‑14天,得到天然利那洛肽的晶体。
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