[发明专利]一种高效籼稻遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种高效籼稻遗传转化方法，该方法包括：籼稻成熟胚愈伤组织的诱导、愈伤组织预培养、农杆菌的培养及农杆菌介导的转化、农杆菌与愈伤组织的共培养、抗性愈伤组织的筛选、分化和再生苗的生根；该方法简便高效，所获得的愈伤组织质量好，适合转化，转化操作流程简便，通过对籼稻品种籼型两系不育系628S和籼型两系恢复系2537进行转化，发现60天左右即可获得籼稻阳性转化植株，转化效率高达35％以上，转化率较高，提高籼稻的遗传转化效率。

主权项

一种高效籼稻遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：愈伤组织的诱导选取成熟良好、完整的籼稻种子的米粒，先用75％的酒精消毒3分钟，再浸泡于25％(V/V)的次氯酸钠溶液，并置于150rpm、25℃的摇床上消毒20分钟；在超净工作台上，将上述消毒后的种子用无菌水洗涤4‑5次，然后转移至无菌滤纸上吸干水分，再将适量的种子接种于NB培养基，在28‑30℃下光照培养8‑10天，诱导愈伤组织；步骤2：愈伤组织的预培养在步骤1所述愈伤组织中挑选结构致密、颜色鲜亮、颗粒状的愈伤组织转入预培养基中，于28‑30℃下光照培养3天用于转化；步骤3：农杆菌的培养及农杆菌介导的转化将含有目的基因的植物表达载体通过电激转化法转入农杆菌菌株EHA105，选取阳性菌株划线于YEB抗性平板，28℃暗培养3天，再用接种针刮取米粒大小的农杆菌震荡悬浮于装有70ml农杆菌浸染液的150ml三角瓶中，并置于150rpm、28℃的摇床上摇10分钟，然后将步骤2所述光照培养3天的籼稻愈伤组织浸泡于上述农杆菌浸染液中，在150rpm、28℃的摇床上摇10分钟；步骤4：农杆菌与愈伤组织的共培养将步骤3所述浸染后的籼稻愈伤组织置于无菌滤纸上吹干，然后将所述愈伤组织转移到共培养基上，共培养基平板预先垫一张无菌滤纸，用1ml的农杆菌浸染液打湿，并除去气泡，28℃暗培养3天；步骤5：抗性愈伤组织的筛选将步骤4所述共培养3天后的愈伤组织置于250ml三角瓶中，用无菌水洗涤4‑5次，直至洗涤液清澈透明为止；然后加入过滤灭菌的500mg/L的羧苄青霉素溶液洗涤所述愈伤组织，室温置于摇床150rpm震荡洗涤15min，再将所述愈伤组织置于无菌滤纸上吸干水分，接种于含有相应筛选剂的筛选培养基上筛选，所述筛选培养的条件为28℃、光照培养20‑22天，中间继代一次，直到长出抗性愈伤组织；步骤6：抗性愈伤组织的分化将步骤5所述筛选后得到的抗性愈伤组织转入含有筛选剂的分化培养基上，于28℃、光照培养18‑23天，中间继代一次，使其再生绿苗；步骤7：再生苗的生根将步骤6所述分化培养基上长出的幼苗转入含有筛选剂的生根培养基中，30℃、光照培养10‑12天，获得再生苗。