[发明专利]一种指示Nrf2‑Keap1相互作用的BiFC细胞内检测方法及系统

摘要

本发明公开了一种指示Nrf2‑Keap1相互作用的BiFC细胞内检测方法及系统，提供了与eGFP N端158位氨基酸融合的Nrf2蛋白和与eGFP C端159位氨基酸融合的Keap1蛋白编码基因重组的表达载体，同时转染细胞后，表达的Nrf2与Keap1相互作用，融合的荧光蛋白eGFP的N端和C端重构成完整荧光蛋白。本发明将BIFC系统瞬时转染细胞或构建成稳定表达细胞系，可观察到细胞核中形成的特异信号，该信号可以特异显示并反映活细胞中Nrf2‑Keap1信号通路活性状态及其变化，为通过检测BiFC荧光变化筛选影响Nrf2‑Keap1相互作用的小分子化合物及抗肿瘤药物奠定基础。

主权项

一种指示Nrf2‑Keap1相互作用的BiFC细胞内检测系统，其特征在于，由若干融合蛋白组合构成，所述融合蛋白包括融合有Nrf2和eGFP缺失C末端的N158蛋白、融合有Keap1和eGFP缺失N末端的C159蛋白对应的编码基因片段以及表达载体pEGFP‑C1删掉编码GFP的编码片段重组构成的表达载体，所述Nrf2和N158之间以及Keap1和C159之间由linker多肽组成；所述融合蛋白组合：A.Nrf2+linker+N158；B.N158+linker+Nrf2；C.Keap1+linker+C159；D.C159+linker+Keap1；BiFC检测时可以任意将AC、AD、BC、BD其中的一个组合同时转染细胞，进行荧光显微检测，这4种组合条件下均可检测到Nrf2‑Keap1在细胞中的相互作用；所述的Nrf2和Keap1为完整的氨基酸序列，所述eGFP的N158为对应氨基酸残基自N末端第1‑159位氨基酸；所述eGFP的C159为对应氨基酸残基自N末端第159‑265位氨基酸，所述的linker的长度为5个氨基酸RSIAT；所述Nrf2蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：1所示；所述Keap1蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：2所示；所述Keap1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示所述eGFP蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；所述RSIAT Linker蛋白的DNA序列如SEQ ID NO：6所示。