[发明专利]一种基于ddPCR定量检测ctDNA的方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于数字PCR检测ctDNA的方法。本发明的一种基于数字PCR定量检测病毒的方法，包括(1)使用循环游离DNA提取试剂盒提取血浆循环游离DNA；(2)循环游离DNA的富集及分离；(3)以步骤(2)中分离出的ctDNA为模板的PCR扩增反应；(4)检测微滴。本发明针对ctDNA在外周血中的含量非常低的特点，采用PCR方法对ctDNA进行富集以及有效的捕获，以捕获的ctDNA为模板进行数字PCR扩增检测，大大提高了检测的灵敏度，从而提高了诊断的准确性，在癌症检测方面，为早期诊断提供了依据，同时本发明公开的基于数字PCR定量检测病毒的方法，操作简单，大大降低了检测成本。

主权项

一种基于数字PCR检测ctDNA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)使用循环游离DNA提取试剂盒提取血浆循环游离DNA；(2)循环游离DNA的富集：将水相和油相混合、振荡配成PCR反应体系并进行乳液PCR扩增，分离水相和油相，得到水相的PCR扩增产物，使用特异性结合循环肿瘤DNA的探针序列捕获所述水相的PCR扩增产物中的循环肿瘤DNA；(3)配置数字PCR反应体系：配制PCR水相，PCR水相包括上游引物、下游引物、PCR模板、PCRmix以及双蒸水，上述配合的比例关系为0.5‑0.7:0.5‑0.7:0.5‑0.7：0.1‑0.2:13‑16:41‑45，所述PCR模板为步骤(2)中PCR扩增产物；配制PCR油相，将65％‑68％的甘油、5％‑10.5％的Trition X‑100、5％‑10.5％的司盘60、5％‑8％的壬基苯基醚IgelCO520依次均匀混合，获得的溶液作为反应油相备用；取1体积水相加到3体积的油相中，涡旋搅拌并反应后，得到油包水微滴PCR反应体系；(4)PCR扩增反应：将上述充分乳化的油水体系分装，手动转移到96孔PCR板上，孔板用锡箱热封后设定PCR反应条件进行PCR扩增，扩增后将96孔PCR板置于QX100A微滴分析仪中，有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性。