[发明专利]表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体

摘要

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体。通过PEDV的M和N基因片段，利用Blunt‑M2表达载体，通过无缝克隆技术，构建出表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体，并在工程细胞中表达M+N双基因融合蛋白。本发明是直接将纯化PEDV的M基因片段连接到Blunt‑M2哺乳动物真核表达载体中，不需要连接至单克隆载体PMD19‑T中，然后M+Blunt‑M2质粒通过同源重组技术，无缝拼接N基因片段，从而获得M+N双基因融合表达载体，其质粒通过PCR技术进行鉴定，测序准确后再转染在细胞中获得成功表达。因此，该真核表达载体的制备比较其他真核表达技术，具有操作步骤简单、反应时间短等特点，适合双基因融合蛋白表达。

主权项

一种表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)根据PEDV的M、N基因及pEASY‑Blunt‑M2表达载体基因的片段序列，设计与合成特异性引物；(2)以PEDV的cDNA为模板，通过PCR技术分别扩增出M与N基因片段，并进行回收纯化，将纯化的M基因片段连接到pEASY‑Blunt‑M2表达载体上，构建出M+Blunt‑M2质粒；(3)以M+Blunt‑M2质粒为模板，扩增质粒的基因片段，回收纯化M+Blunt‑M2基因片段；(4)采用pEASY‑Uni Seamless Cloning and Assembly kit，通过无缝克隆技术将M+Blunt‑M2基因与N基因片段进行重组连接，将连接产物再转化至Trans 1‑T1感受态细胞中，涂布于氨苄青霉素抗性的LB培养基进行培养后，提取M+Blunt‑M2+N质粒进行测序鉴定，得到表达PEDV的M+N双基因的真核表达载体。