[发明专利]一种用于猪瘟疫苗效力检验的荧光定量PCR方法

摘要

本发明公开了一种用于猪瘟疫苗效力检验的荧光定量PCR方法，属于生物技术领域，包括如下步骤：病毒核酸的提取、c DNA的合成、标准品制备、荧光定量PCR特异性试验。本发明优化反应条件，建立定量PCR方法，方法特异性好，对PRV、PCV2、PPV、PRRRSV、BVDV均无扩增，敏感性高，检出限制为1.29copy，批内批间均有很好的重复性，该荧光定量PCR方法与传统兔体反应热方法相关性好，可在8～10h内完成大量样品检测，克服兔体实验的缺点，敏感特异，重复性良好，节省人力物力，减少实验兔的使用。

主权项

1.一种用于猪瘟疫苗效力检验的荧光定量PCR方法，其特征在于，上游引物5'GCTAGAAACAGGCCAACAAC 3'下游引物5'GAGTAAACTGCCGCACTCAT 3'产物144bp探针5'CCGCACTCATGATCCCCAT 3'，5’标记FAM,3’标记MGB包括如下步骤：步骤1：病毒核酸的提取分别取PPV、PRV、PRRSV、BVDV、CSFV200μL，按生物病毒基因组DNA/RNA快速提取试剂盒的说明方法提取总DNA/RNA；步骤2：c DNA的合成反转录采用10μL体系，反应管中依次加入5×Buffer、M‑MLV反转录酶、RNasin、10mM dNTP、10μM下游引物和病毒RNA至10μL，反应后得到cDNA模板，保存备用；步骤3：标准品制备在25μL体系中进行目的DNA片段的PCR扩增，经目的DNA片段回收纯化、连接、转化及重组质粒提取，制备标准品；步骤4：荧光定量PCR特异性试验荧光定量PCR使用TAKARA TP800荧光定量PCR仪进行，反应体系为：Premix Ex Taq，上、下游引物，探针，模板和DDH2O；经预变性，进行40个循环，采集荧光信号，进行TaqMan real‑time RT‑PCR扩增。