[发明专利]使血液单个核细胞逆向分化产生人血源性自体视网膜干细胞的方法、试剂盒及用途

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及生物医学技术领域，更具体涉及一种使人的体细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞的细胞培养方法、试剂盒和应用。所述的制备方法通过将自体细胞作为原料细胞依次经细胞培养液A1、细胞培养液A2和细胞培养液A3培养后得到血源性自体视网膜干细胞。本发明应用人自体血液细胞作为原料细胞，使之逆向分化生产人血源性自体视网膜干细胞。本发明应用小分子物质组成的细胞培养液配方，在不改变人的体细胞染色体DNA序列，不插入任何外来基因或DNA片段的情况下，快速使人的自体血液细胞逆向分化产生血源性自体视网膜干细胞。本发明在生产速度、产量、纯度方面均明显优于现有技术。

主权项

1.使人体的单个核细胞逆向分化产生自体视网膜干细胞的一组培养液，其特征在于：所述的 一组培养液包括细胞培养液A1、细胞培养液A2和细胞培养液A3；所述的细胞培养液A1、细胞培养液A2和细胞培养液A3在10～100级洁净度的安全操作台里操作，4～10℃的低温条件下配制；细胞培养液A1的配制：在500mL DMEM培养液中加入以下成分：10μM的RHO激酶抑制剂Y‑27632、10ng/mL的干细胞因子、10ng/mL的白细胞介素3、10ng/mL的白细胞介素6、 10ng/mL的白细胞介素11、10ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子、10ng/mL的粒细胞集落刺激因子、10μg/mL的岩藻多糖、10μg/mL的葡聚糖硫酸酯、10nM的AMD 3100、10μM的 M‑阿仑膦酸钠、10μM的氨羟二磷酸二钠、10ng/mL的神经 生长因子和10μM的二甲亚砜；充分溶解，然后经0.22微米 孔径的滤器过滤、消毒，配制成细胞培养液A1；细胞培养液A2的配制：在500mL DMEM培养液中加入以下成分：10ng/mL的Dkk1蛋白、10ng/mL的Noggin蛋白、10ng/ mL的γ‑分泌酶抑制剂DAPT、10ng/mL的Sonic hedgehog蛋白、10ng/mL的胰岛素样生长因子、10ng/mL的细胞周期蛋白依赖性激酶抑 制因子7、10ng/mL的SMAD3抑制剂SB431542、10ng/mL的 Lefly蛋白、500nmol/L的视黄酸、100nmol/L的激活素A、10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、100μM的RHO激酶抑制剂 Y‑27632、10ng/mL的白细胞介素3、10ng/mL的白细胞介素 6、10ng/mL的神经生长因子和10ng/mL的干细胞因子；充分溶解，然后经0.22微米孔径的滤器过滤、消毒，配制成细胞培养液A2；细胞培养液A3的配制：在500mL DMEM培养液中加入以下成分：10ng/mL的Dkk1蛋白、10ng/mL的Noggin蛋白、10ng/ mL的γ‑分泌酶抑制剂DAPT、10ng/mL的Sonic hedgehog蛋白、10ng/mL的胰岛素样生长因子、10ng/mL的细胞周期蛋白依赖性激酶抑 制因子7、10ng/mL的SMAD3抑制剂SB431542、10ng/mL的 Lefly蛋白、200nmol/L的视黄酸、100nmol/L的激活素A、10ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子、10μM的RHO激酶抑制剂Y‑ 27632、10ng/mL的白细胞介素3、10ng/mL的白细胞介素6、10ng/mL的神经生长因子、10ng/mL的干细胞因子、10ng/mL的成纤维细胞生长因子2、10ng/mL的成纤维细胞生长因子8、10ng/mL的表皮生长因子、10ng/mL的GSK‑3α/β抑制剂CHIR、10ng/mL的TGFβR‑1/ALK5抑制剂RepSox、10ng/mL的FGFR1 特异性拮抗剂SU5402、10ng/mL的脑源性神经营养因子； 10ng/mL的神经营养因子‑3、10ng/mL的血管内皮生长因子和 10ng/mL的生长因子；充分溶解，然后经0.22微米孔径的滤器过滤、消毒，配 制成细胞培养液A3。