[发明专利]一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法和试剂盒。本发明中，根据退火温度来设计相应的blocker引物，在blocker的退火温度下，Blocker引物与野生型模板结合，阻断野生型的扩增，同时使用ARMS技术来降低野生型背景的扩增。本发明通过将Blocker富集技术以及ARMS荧光定量PCR技术整合在一个反应体系中，一步即可实现对突变基因的富集和鉴定，减少了操作步骤，提高了检测灵敏度和特异性。

主权项

一种基于Blocker引物和ARMS引物检测基因突变的方法，在包括样本DNA、Blocker引物、ARMS引物、TaqMan探针、聚合酶及缓冲液的同一反应体系中，依次进行阻断富集PCR反应和ARMS荧光定量PCR反应，该方法包括以下步骤：1)首先在Blocker引物的退火温度下，Blocker引物与野生型模板优先结合从而阻断ARMS引物与野生型模板结合，然后在ARMS引物的退火温度下，ARMS引物与突变型模板结合，通过PCR反应富集扩增样本DNA中包含待测基因突变区域的片段，其中，所述Blocker引物为与所检测突变区域的野生型序列完全互补且3’末端进行修饰以阻止其延伸的寡核苷酸，所述ARMS引物的3’末端位于突变区域处，可扩增包含待测基因突变区域的片段并且与突变型序列一致，其中，在所述ARMS引物的3’末端第2个、第3个碱基或第4个碱基处再引入一个错配碱基，其中，所述Blocker引物的退火温度比所述ARMS引物的退火温度高20～25℃；2)在反应1)的基础上，ARMS引物及5’端FAM标记的Taqman探针通过荧光定量PCR反应对所述突变基因进行荧光检测；其中所述基因突变为EGFR基因点突变T790M，其中，所述Blocker引物的序列为5’‑TGCAGCTCATCACGCAGCTCATG‑3’ddC(SEQ ID NO:1)，所述上游ARMS引物的序列为：5’‑CACCGTGCAGCTCATTAT‑3’(SEQ ID NO:2)，下游引物的序列为：5’‑CACACACCAGTTGAGCAGGTACT‑3’(SEQ ID NO:3)；所述Taqman探针的序列为：5’‑CCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGT‑3’(SEQ ID NO:4)。