[发明专利]一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法

摘要

本发明涉及一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法，属于基因工程和遗传修饰领域。本发明改造pX458载体，使其带有DsRed2和ECFP，然后针对目标基因设计多个特异性的sgRNA位点，将其连接至改造载体中，转染细胞系后利用流式细胞仪对细胞群进行分选，可以非常快速获得基因组被编辑的单细胞，然后用PCR扩增单细胞DNA序列，通过凝胶电泳即可以从中挑选出具有大片段缺失的单细胞。本发明通过将CRISPR/Cas9系统、流式细胞仪单细胞分选和表达载体上的荧光蛋白筛选三者结合起来，可以在短时间内获得具有大片段缺失的阳性单克隆，极大地提高细胞系基因敲除工作效率。

主权项

一种通过CRISPR/Cas9系统快速获得大片段缺失的细胞系基因敲除方法，其特征在于：包括如下步骤：1)选定待敲除的目标基因，使用在线sgRNA设计软件，获得至少两个sgRNA序列，sgRNA序列之间的间隔为50‑100bp；2)将步骤1)获得的sgRNA序列添加酶切位点并合成单链引物，将配对的引物退火得到对应的带有粘性末端的双链DNA片段，将双链DNA片段分别连接入带有不同荧光报告基因的CRISPR/Cas9系统表达载体中，一个双链DNA片段对应连接一个带有荧光报告基因的CRISPR/Cas9系统表达载体，将构建好的表达载体等量混合后转入细胞；3)细胞经培养后使用流式细胞仪进行阳性筛选，分离包含全部荧光报告基因信号的单克隆细胞；4)将获得的单克隆细胞扩大培养，10‑15天后取细胞通过直接裂解法获取基因组DNA；5)设计包含靶位点PCR检测引物，以步骤4)获得的基因组DNA为模板进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳检测，挑选大片段缺失的纯合子细胞系。