[发明专利]PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法及应用

摘要

本发明提供PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法及应用，属于分子生物学和病毒学领域。构建PEDV JS2008株全长感染性cDNA的方法，包括如下步骤：以PEDV JS2008株病毒总RNA的反转录产物为模板，扩增6片段，分别插入载体pSMART中，然后将位置不合适的内切酶PflmI酶切位点进行沉默突变；将各重组载体酶切，回收目标的cDNA片段，连接后得到所述PEDV JS2008株全长感染性cDNA。本发明PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法，该方法巧妙，效率高，可以应用于拯救猪流行性腹泻病毒，以研究PEDV致病机制及新型疫苗。

主权项

一种构建PEDV JS2008株全长感染性cDNA的方法，包括如下步骤：（1）以PEDV JS2008株病毒总RNA的反转录产物为模板，采用引物A‑1‑F和A‑4997‑R扩增PEDV‑A片段，采用引物B‑4971‑F和B‑11100‑R扩增PEDV‑B片段，采用引物C‑11073‑F和C‑16216‑R扩增PEDV‑C片段，采用引物D‑16194‑F和D‑19726‑R扩增PEDV‑D片段，采用引物E‑19702‑F和E‑24860‑R扩增PEDV‑E片段，采用引物F‑24832‑F和F‑27954‑R扩增PEDV‑F片段；（2）将步骤（1）PCR扩增获得的6片段，分别插入载体pSMART中，得到插入了PEDV‑A片段的重组载体pS‑A、插入了PEDV‑B片段的重组载体pS‑B、插入了PEDV‑C片段的重组载体pS‑C、插入了PEDV‑D片段的重组载体pS‑D、插入了PEDV‑E片段的重组载体pS‑E、插入了PEDV‑F片段的重组载体pS‑F；（3）将重组载体pS‑B内PEDV‑B片段 、重组载体pS‑D内PEDV‑D片段 、重组载体pS‑F内PEDV‑F片段中的内切酶PflmI酶切位点进行沉默突变，分别得到重组载体pS‑mB、pS‑mD和pS‑mF；（4）将重组载体pS‑A使用XbaI和PflmI进行双酶切，将重组载体pS‑mB、pS‑C、pS‑mD和pS‑E使用PflmI进行单酶切，将重组载体pS‑mF使用PflmI和EcoRV进行双酶切；回收各重组载体酶切后的cDNA片段，连接后得到所述PEDV JS2008株全长感染性cDNA。