[发明专利]一种低污染及高敏感的低成本通用菌种分子鉴定方法

摘要

一种低污染及高敏感的低成本通用菌种分子鉴定方法，属于生物技术领域。其包括以下步骤：1）菌种预处理；2）准备高吸附力的柱子；3）菌裂解和核酸吸附；4）清洗；5）洗脱；6）第一轮PCR扩增；7）第二轮PCR扩增；8）电泳检测和纯化；9）用引物M13F测序比对，确定属和种。本发明利用简易和高效的破壁和提取技术，再结合高效的核酸吸附技术，以及PCR的两次放大效应，可以在微生物菌落形成的初期，即能较为准确的鉴定菌，并且本发明用于鉴定的引物兼顾了真菌和细菌位点的统一性，不但对细菌能在种水平进行鉴定，对真菌也能够达属甚至种的水平，这样就方便了一些细菌和真菌的同时鉴定，大大提高了效率，节约了实验成本。

主权项

一种低污染及高敏感的低成本通用菌种分子鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：1）菌种预处理从平板上挑取待测菌，所述待测菌直径2mm以上，加入至悬浮溶液A中，再进行机械粉碎破壁；2）准备高吸附力的柱子取带过滤柱的离心管，加入吸附剂悬液S，离心处理，使吸附剂在过滤柱中形成斜面，舍弃滤液；3）菌裂解和核酸吸附加入裂解液L到步骤1）预处理后的菌液中，上下剧烈震荡，静置，离心，再取上清加入到步骤2）制好的吸附柱中，室温放置，离心，舍弃滤液，收集管重新放回；4）清洗取步骤3）得到的上清液加入清洗液W，离心，清洗，每次倒掉收集管的滤液，最后一次甩15s后，吸附柱不再放回收集管，所述的清洗液W为浓度70%的酒精溶液；5）洗脱将吸附柱转移到新离心管中，滴上洗脱液E 10‑15ul，盖紧盖子，保持60℃、5‑10min，离心，收集到的滤液即为提取到的微量核酸溶液，所述的洗脱液E为灭过菌PH8.5的Tris溶液；6）第一轮PCR扩增取步骤5）得到的微量核酸溶液为模板，以引物SF1和SR1进行PCR扩增，引物SF1的核苷酸序列如SEQ No 1所示，引物SR1的核苷酸序列如SEQ No 1所示；7）第二轮PCR扩增取步骤6）得到的反应液的1/1000为模板，以引物MSF1、SR1和M13F进行PCR扩增，引物MSF1的核苷酸序列如SEQ No 3所示，引物M13F的核苷酸序列如SEQ No 4所示；8）电泳检测和纯化；9）用引物M13F测序比对，确定属和种。