[发明专利]一种快速检测土壤中病原微生物的方法

摘要

本发明涉及环境微生物及分子生物学领域，尤其涉及一种利用环介导恒温扩增检测土壤中病原微生物存在的方法。本发明方法包括环介导恒温扩增引物的获得、DNA的提取和扩增、所检测微生物的种类的判定。本发明实现了对土传病原微生物的高效、快速、定性检测，无需PCR扩增即可通过肉眼判断靶标微生物的存在。本发明适用于环境检测、食品检测、病原菌检测等领域。

主权项

1.一种环境检测方法，其特征在于，包括利用环介导等温扩增定性检测靶标微生物的存在，所述微生物为土传病原微生物，所述土传病原微生物为病毒和细菌，所述病毒为大麦黄花叶病毒，所述细菌为立枯丝核菌、腐霉菌和黄萎轮枝孢菌，所述方法包括：步骤1、提取获得环境中土壤微生物总DNA序列；步骤2、按如下反应体系扩增土壤微生物总DNA样品：步骤3、于55℃反应3分钟，之后于95℃反应5分钟，冷却至常温，在产物中加入PicoGreen，通过颜色区别判断产物量，阳性产物颜色由橙色变为黄色，阴性产物则保持黄色不变；步骤4、所述引物用于检测大麦黄花叶病毒、立枯丝核菌、腐霉菌以及黄萎轮枝孢菌，所述引物包括：大麦黄花叶病毒BYMV：BYMV‑BIP：5‑GATTGTCCGTGGCTCTGGCTC‑GTCT CAAGGGGCGAATC‑3BYMV‑FIP：5‑TCCGATACGAGGTGCGGC‑GTTT CCCAGAAGGGCTACC‑3BYMV‑B3：5‑GGCTTTGTCAGGCGATCGTAGC‑3BYMV‑F3：5‑GCATCGTAGCTCGAAGCTAGCTAG‑3立枯丝核菌Rhi:Rhi‑BIP：5‑AATTCGTCCGTAGGAATCGAT‑GTGG GTGTCCGTAGCGT‑3Rhi‑FIP：5‑CAGCGTAGGTTAACGTAC‑TTGT AGCTGTCGTCCACAAC‑3Rhi‑B3：5‑GCGGTGTCAGTATCTAGGATC‑3Rhi‑F3：5‑TCTAGCGTAGCCGGTAGATCGTACTT‑3腐霉菌Pyt：Pyt‑BIP：5‑GCGAATCGACATCGTTAACGTAG‑TGGT TCGGAGCCCTAAGAG‑3Pyt‑FIP：5‑TACTAGGAACTCTCAAATCT‑TTGG CGAATCGGGCGTAAGTCG‑3Pyt‑B3：5‑CCTTGAGAGAATCGTGTACGTGCCTA‑3Pyt‑F3：5‑TCGGTAACGTAGCAGTAGTCGGTAGC‑3黄萎轮枝孢Ver：Ver‑BIP：5‑TGCCAAATCGGTATCAATCCAGACT‑TTGG GCTACTCGGTCGAT‑3Ver‑FIP：5‑GCTACGTCCTAGCTGTTCGTC‑GTGG CCCAGTGATTTTGAGTT‑3Ver‑B3：5‑GTGGTGAAGCCTAGCTAGGTCAGTAG‑3Ver‑F3：5‑CCTATCATGGGACAGCAGCGGGAC‑3所述方法为一种以土壤为样本通过LAMP快速检测技术同时检测出大麦黄花叶病毒、立枯丝核菌、腐霉菌以及黄萎轮枝孢菌四种土传病原菌的方法。