[发明专利]一种从法夫酵母中分离纯化海胆酮的方法

摘要

本发明公开了一种从法夫酵母中分离纯化海胆酮的方法,先通过乳酸破壁、丙酮粗提的方法从法夫酵母中得到类胡萝卜素粗提物，再利用HSCCC‑硅胶柱层析联合的方法进一步分离纯化，最后通过高效液相色谱、质谱的方法鉴定得到海胆酮，从而实现从法夫酵母中直接分离纯化出天然的海胆酮的目的，所得到的海胆酮纯度高、杂质少。

主权项

1.一种从法夫酵母中分离纯化海胆酮的方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、制备类胡萝卜素粗提物：准确称取10g法夫酵母菌体，加入200mL的6mol/L乳酸溶液，30℃破壁10min，破壁后4500rpm离心10min，去除粘稠的乳酸溶液，量取200mL蒸馏水加入剩余的菌体中，搅拌均匀，4500rpm离心10min，去除上层蒸馏水，反复水洗3次，保留菌体于杯底，加入200mL丙酮溶液，常温浸提5min，4500rpm离心10min，收集上清液，旋转蒸发后即得到类胡萝卜素粗提物；S2、配置HSCCC溶剂体系：按照正己烷：丙酮：乙醇：水的体积比为1.2:1:1:0.8的比例量取各溶剂于分液漏斗中，并在15‑25℃下充分震荡，静置分层，分别收集上相和下相溶液，超声20min，以上相作为HSCCC的流动相，下相作为HSCCC的固定相；S3、洗脱：以上相作为HSCCC的流动相，下相作为HSCCC的固定相，采用正向模式，即从尾到头进行洗脱，首先将下相溶液固定相以30mL/min的流速泵满色谱柱，将转数调至350‑850rpm后，以1‑15mL/min的流速将上相溶液流动相泵入色谱柱中；S4、进样：待主机螺旋管内流动相与固定相达到动力学平衡，即检测器端口只有流动相被置换出时，可准备进样，样品从进样环注入管路的同时点下色谱工作站中的记录按钮，紫外检测波长设置为474nm，根据紫外吸收色谱图手动收集各馏分；S5、硅胶柱层析分离：将HSCCC分离得到的各个组分用正相硅胶柱层析进一步分离，将硅胶置于80℃烘箱活化2h，称取22.1g活化的200‑300目的硅胶于烧杯中，加入100mL石油醚搅拌均匀，湿法装柱，柱子规格为35×1.5cm的玻璃柱，待硅胶自然沉降，石油醚平衡至柱体积不再变化，最后装填高度为25.1cm，将样品溶于少量的二氯甲烷，湿法上样，用不同比例的石油醚/丙酮进行梯度洗脱，按条带收集组分；S6、组分鉴定：将步骤S4收集到的组分按顺序编号，以海胆酮标准品作为对照，利用高效液相色谱、质谱的方法进行鉴定，通过分析各编号样品与海胆酮的质谱图，即可确定某一编号对应的组分为海胆酮。