[发明专利]一种细胞分裂素通过核苷转运体引起人白血病细胞凋亡的应用

摘要

本发明提供了一种细胞分裂素通过核苷转运体引起人白血病细胞凋亡的应用，属于生物化学与分子生物学技术领域。本发明的数据建立在oTR对人的9大瘤系60种肿瘤细胞系具有非常显著的体外增殖抑制活性，其中对白血病细胞株的药物敏感性最强的基础之上。本发明的数据以细胞分裂素oTR的基本化学结构为理论依据，oTR是一种核苷类似物，而细胞膜表面有多种分子通道，研究oTR通过哪种分子通道进入细胞，为研究其抗肿瘤作用提供了基础。

主权项

一种细胞分裂素通过核苷转运体引起人白血病细胞凋亡的应用，其特征在于，步骤如下：(1)细胞培养：从液氮中取出人白血病THP‑1细胞冻存管，放入37℃水浴锅中迅速融化，将细胞吸出放入离心管中，1000rpm/min离心5min，倒掉上清，将人白血病细胞株THP‑1悬浮于含有灭活胎牛血清的无菌DMEM培养液中，置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中培养，细胞长至培养瓶底面积的70％～80％传代1次；(2)药物配制：Ara‑C用无菌DMEM培养基溶解，oTR用0.1％DMSO溶解，继续用无菌DMEM培养基将溶解好的Ara‑C和oTR稀释至浓度为1μM‑300μM；拮抗剂用DMSO溶解至浓度为5mM；过滤除菌，室温保存；所述的拮抗剂包括两类，分别为腺苷受体拮抗剂和核苷转运体拮抗剂，腺苷受体拮抗剂包括DPCPX、SCH58261、MRS1754和MRS1191；核苷转运体拮抗剂为Dipyridamole；(3)检测细胞形态学变化：将处于对数生长期的5×105～1×106个细胞接种于每孔含有3ml DMEM培养液的6孔板中，设置3组实验，每组两个复孔；分别是：第1组：空白对照组；第2组：0.3μM oTR组；第3组：1.5μM oTR组；置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育3‑5天，光学倒置显微镜下观察细胞形态；(4)药物处理细胞：收集对数生长期的THP‑1细胞，用血球计数板进行细胞计数，按照5×104/ml密度稀释细胞，加入含10％FBS的DMEM培养基，每孔100μl细胞悬液接种于96孔板中；设置9组实验组及1组对照组，每组5个复孔，分别是：第1组：空白对照组；第2组：0.1％DMSO组；第3组：0.3μΜ oTR组；第4组：1.5μΜ oTR组；第5组：15μΜ oTR组；第6组：30μΜoTR组；第7组：0.3μΜ Ara‑C组；第8组：1.5μΜ Ara‑C组；第9组：15μΜ Ara‑C组；第10组：30μΜ Ara‑C组；置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育4天；台盼蓝染色检测活细胞/死细胞，向细胞悬液中加入0.4％台盼蓝溶液，使台盼蓝终浓度为0.04％，在三分钟内用血球计数板分别计数活细胞和死细胞，记录数据；(5)检测拮抗剂对oTR作用的影响：将处于对数生长期的5×103～5×104个细胞接种于每孔含有100μl DMEM培养液的96孔板中，设置5组实验，分别为：第1组：DPCPX组；第2组：SCH58261组；第3组：MRS1754组；第4组：MRS1191组；第5组：Dipyridamole组；每组再设空白对照组、拮抗剂单独作用组、1.5μM oTR处理组以及拮抗剂与oTR联合作用组，各5个复孔；拮抗剂的工作浓度为5μM，拮抗剂与oTR联合作用组中oTR的工作浓度为1.5μM；置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中培养4天；采用CCK‑8试剂盒进行检测，每孔细胞悬液中加10μl CCK‑8溶液，置于37℃，CO2培养箱中孵育2h，测定450nm处各组细胞的吸光度，记录数据。