[发明专利]一种针对电子烟气溶胶水提物的细菌回复突变试验

摘要

本发明公开了一种针对电子烟气溶胶水提物的细菌回复突变试验。包括样品前处理、受试菌培养、受试菌浓度的确定、S9混合液的配制、受试物的分组、受试物的培养、结果判定等步骤。本发明综合考察了电子烟制品的使用特点和作用方式，建立了全新的电子烟烟雾样品前处理方法(捕集瓶捕集法)，并确定了样品检测剂量，形成了适合电子烟气溶胶水提物的细菌回复突变试验方法。样品的有效处理、检测剂量的优化设定，使得本发明方法能够准确有效的检测电子烟气溶胶水提物的遗传毒性。

主权项

一种针对电子烟气溶胶水提物的细菌回复突变试验，具体为以下步骤：(1)样品前处理：采用直线型吸烟机，在抽吸容量为55.0ml，抽吸持续时间3s，抽吸频率30s的条件下，连续抽吸100口电子烟，用装有FM细胞培养基的捕集瓶捕集烟雾，捕集浓度为20口/mL，捕集液用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，得到电子烟烟雾的气溶胶水提物作为待测液，‑80℃保存待用；(2)受试菌的培养：将TA98和TA100鼠伤寒沙门氏工程菌分别加入到装有培养基的无菌三角瓶中，置于37℃条件下，静置培养16h或100次/min振荡培养10h；(3)受试菌浓度的确定：用紫外分光光度计分别测定培养所得TA98和TA100鼠伤寒沙门氏工程菌在600nm下的OD值，然后用培养基稀释菌液至其OD600值为0.5；(4)S9混合液的配制：将1.65mol/L的氯化钾溶液和0.4mol/L的氯化镁溶液按照1:1的体积比混合后配制成氯化钾‑氯化镁溶液；取磷酸缓冲液、氯化钾‑氯化镁溶液、0.05mol/L的葡萄糖‑6磷酸钠盐缓冲液和0.025mol/L的辅酶‑Ⅱ溶液，按照30:2:5:8的体积比混合，用0.22μm无菌过滤器过滤除菌后，与S9代谢活化液按照9:1的体积比混合，配制成S9混合液备用；(5)受试物的分组将受试物分为四组：自发回变组、溶剂对照组、阳性对照组和样品测试组；其中，样品测试组按表1所示的不同剂量将待测液加入培养中；自发回变组、溶剂对照组和阳性对照组则按表2所示的不同剂量将待测液加入培养中；将自发回变组、溶剂对照组、阳性对照组、样品测试组样品分别按表3所示的4个检测体系加样；表1 Ames细菌回复突变试验样品测试组加样表表2 Ames细菌回复突变试验自发回变组、溶剂对照组、阳性对照组加样表表3 Ames细菌回复突变试验4个检测体系加样表(6)受试物的培养将各组受试物分别加入到2.0mL，40℃水浴保温的0.6％(W/V)琼脂顶层培养基中，混匀后迅速倒入1.8％(W/V)琼脂底层培养基中，转动平皿使顶层培养基均匀分布在底层上，平放固化，每个剂量设3个复皿，置于37℃、5％CO2培养箱中培养48h，观察结果；(7)结果判定计算培养长出的回变菌落数，在背景生长良好的条件下，样品测试组诱发的回变菌落数等于或大于自发回变组菌落数的2倍以上，并有剂量效应关系，即认为样品测试组试验结果为阳性。