[发明专利]一种茼蒿抑菌活性单体的制备方法

摘要

本发明公开了一种茼蒿抑菌活性单体及其使用方法，属于活性物质的分离及使用方法技术领域，该茼蒿抑菌活性单体通过茼蒿茎叶预处理、浸提、大孔树脂柱层析、C18中压色谱分离、葡聚糖凝胶LH‑20柱层析、半制备液相分离处理。本发明所提出一种茼蒿抑菌活性单体，其能够提取高效的抑菌活性的单体，可以很好地抑制西瓜枯萎病菌，具有良好广阔的应用前景。

主权项

1.一种茼蒿抑菌活性单体的制备方法，其特征是包括以下步骤：/nS1：茼蒿茎叶预处理：称取新鲜的茼蒿茎叶20Kg，自然晾干后，于45-55℃鼓风干燥机中干燥10-14h，精确称取1.7-2.3Kg干燥后的茼蒿，于中药材粉碎机中粉碎，过40目筛；/nS2：浸提：加入48-52L的95％乙醇超声波辅助提取2-4次，每次1-3h，合并滤液减压浓缩，得到浸膏；/nS3：大孔树脂柱层析：浸膏溶解于1.1-1.3L蒸馏水中，过滤，上清液上于D101大孔树脂柱中，依次用蒸馏水、10％甲醇、30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇和90％甲醇梯度洗脱，每个梯度洗脱1.9-2.1L溶剂，流速2.5-3.5mL/min，分别回收每个梯度洗脱后的洗脱液，进行减压回收得到六个馏分，将西瓜枯萎病菌接种于含有不同馏分的PDA培养基中，置于28摄氏度的恒温培养箱培养4d，筛选出其中菌落直径最小对应的馏分A；/n所述D101大孔树脂柱的直径为3.0-5.0cm，大孔树脂柱长度为23-27cm；/nS4：C18中压色谱分离：取S3的A馏分经C18中压色谱(MPLC)分离，甲醇:水梯度洗脱，依次用5％甲醇、15％甲醇、25％甲醇、35％甲醇和50％甲醇梯度洗脱，每个梯度洗脱0.8-1.2L溶剂，流速2.5-3.5mL/min，各梯度洗脱后的洗脱液经HPLC检测，筛选合并相同馏分，形成不同梯度的B类馏分，将西瓜枯萎病菌接种于含有不同B类馏分的PDA培养基中，置于28摄氏度的恒温培养箱培养4d，筛选菌落直径最小B类馏分中的一种，定义为B1馏分；/nS5：葡聚糖凝胶LH-20柱层析：将S4中B1馏分经SephadexLH-20凝胶柱层析分离，依次用5％甲醇、15％甲醇、25％甲和35％甲醇洗脱，每个梯度洗脱0.9-1.1L溶剂，流速2.5-3.5mL/min，HPLC检测合并相同馏分，形成不同梯度的C类馏分，将西瓜枯萎病菌接种于含有不同C类馏分的PDA培养基中，置于23-33摄氏度的恒温培养箱培养3-5d，筛选菌落直径最小的馏分，定义为C1馏分；/nS6：半制备液相分离：S5所得C1馏分经半制备液相分离，依次用18％甲醇、27％甲醇、36％甲醇和45％甲醇洗脱，每个梯度洗脱0.9-1.1L溶剂，流速2.5-3.5mL/min，HPLC检测合并相同馏分，形成不同梯度的D类馏分，将西瓜枯萎病菌接种于含有不同D类馏分的PDA培养基中，置于28摄氏度的恒温培养箱培养4d，菌落直径最小的馏分为茼蒿抑菌活性单体，所述茼蒿抑菌活性单体为绿原酸。/n