[发明专利]一种检测核酸酶对特定碱基3′-5′外切活性的方法和试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测核酸酶对特定碱基3'‑5'外切活性的方法和试剂盒。本发明首次提出检测酶对特定碱基的外切活性；利用该发明可以检测任一碱基，包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP以及简并碱基等，应用范围十分广泛；该发明可以检测大多数核酸酶的3’‑5’外切活性；使用荧光作为检测信号，避免了放射性污染，且灵敏度高；无需荧光基团修饰的核苷酸链，成本低；可以用来快速大量地筛选核酸酶，应用灵活，通量高。

主权项

1.一种检测核酸酶对特定碱基3'‑5'外切活性的方法，包括如下步骤：1)根据含有已知序列的单链DNA分子设计合成与所述已知序列互补的引物；该引物中按照5’‑3’的顺序倒数第二个碱基和倒数第三个碱基之间的磷酸二酯键作防止外切酶外切修饰，5’端碱基用防止外切酶外切修饰，3’端最后一个碱基为特定碱基；所述含有已知序列的单链DNA分子上设有碱基甲和碱基乙；所述碱基甲为所述已知序列中与所述引物中特定碱基对应配对的碱基；所述碱基乙为所述已知序列中从5’端起所述碱基甲上游紧邻的第一个碱基；所述碱基甲和所述碱基乙不同；2)将固定在固相上的所述含有已知序列的单链DNA分子与所述引物杂交，再用不同的待测核酸酶酶切杂交的产物，得到酶切产物；3)向所述酶切产物中引入DNA聚合酶和荧光修饰目标dNTP,聚合反应，根据聚合反应产生的荧光信号来判断所述不同的待测核酸酶对特定碱基3'‑5'外切活性；所述荧光修饰目标dNTP与所述碱基甲或所述碱基乙互补。