[发明专利]一种江珧贝壳DNA提取方法、鉴定引物及试剂盒

摘要

本发明公开了一种江珧贝壳DNA提取方法、鉴定引物及试剂盒，该提取方法只选取江珧贝壳腹缘部100mg左右的少量贝壳作为提取样品，研碎贝壳后加入EDTA溶液对贝壳粉末进行脱钙，然后，进行蛋白消化，释放DNA，再加入抽提液将蛋白质、多糖以及脂类等杂质与DNA分离，即可得到用于分子生物学实验以及遗传育种检测的DNA样品。整个过程操作简单且快速，提取的DNA质量较好并且能长期保存。取样部位来自贝壳边缘，不伤害用来育种的亲贝个体，为贝类特别是大型贝类的分子育种工作奠定了基础。

主权项

一种江珧贝壳DNA提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将江珧贝壳用去离子水浸泡冲洗后，用刷子洗刷干净，去掉表面的杂质及组织残留，置于电热鼓风干燥箱中65℃烘干6h，直到贝壳完全烘干；(2)从江珧贝壳的腹缘取少量贝壳样本，用砂纸将贝壳样本的最外层磨掉，粉碎成粉末；(3)过滤后的粉末转入灭菌的1.5ml EP管中，再加入1000μl的EDTA后，置于摇床中脱钙24小时，脱钙处理后将样品置于离心机中以4000rpm的转速离心15分钟，弃滤液，用50μl去离子水洗涤沉淀，以去除脱钙残留下来的盐离子；(4)重复用50μl去离子水洗涤沉淀两次，然后加600μl、pH值为8.0的Tris‑Hcl和20μl蛋白酶K，56℃温度条件下，消化6小时；(5)加入600μl的抽提液，充分混匀后，12000rpm离心10分钟，然后将上清液移至另一个1.5ml EP管中，再继续用等体积的抽提液再抽提一次，12000rpm离心10分钟，收集上层水相；(6)加入600μl的氯仿，充分混匀后，12000rpm离心10分钟，然后将上清液移至新的1.5ml EP管中，加入‑20℃预冷的等体积的异丙醇，充分混匀后，12000rpm离心10分钟，弃上清，然后用50μl，75％乙醇洗涤沉淀，重复洗涤一次；(7)将EP管置于通风处晾干后，用5μl去离子水溶解DNA样品。