[发明专利]一种制备异枝江蓠原生质体的方法

摘要

本发明公开了一种制备异枝江蓠(Gracilaria bailinae)原生质体的方法，本发明的方法通过培养海洋细菌Marinomonas sp.YS‑70发酵产生琼胶酶粗酶液，混合纤维素酶、离析酶及添加缓冲介质和渗压剂组成原生质体分离液，对经过消毒、切碎的异枝江蓠藻体进行酶解处理，使其释放出游离原生质体。本发明采用异枝江蓠原生质体的分离的琼胶酶，其中包含多种酶活性，产量多，能够使细胞壁解离充分，成本低而且高效。离析酶与纤维素酶和琼胶酶互相配合起协同作用，效率高，所需时间短，仅需要解离4h，可得到大量的原生质体，有利于提高原生质体的产量及其存活率。解离后原生质体活性强，后续的培养存活率高及细胞壁再生能力强。而且本发明的异枝江蓠不需要预处理，有利于节省成本。

主权项

一种制备异枝江蓠原生质体的方法，其特征在于，主要包括以下步骤：1)样品挑选：选取健康、无损伤的异枝江蓠，清洗异枝江蓠表面备用；2)样品处理：将1)中清洗过的异枝江蓠截取尖端3厘米后进行处理，消除异枝江蓠表面的杂藻及有害微生物；3)琼胶酶粗酶液制备：培养海洋细菌Marinomonas sp.YS‑70，用2％的接种量发酵培养，产生琼胶酶粗酶液，储存在‑80℃冰箱中；4)原生质体分离液的制备：将MES‑Tris和CaCl2·2H2O加入去离子水中配置成浓度为25mM的基液，然后把基液与步骤3)所得琼胶酶粗酶液按体积比4:6混合，再在混合液中加入2％w/v的纤维素酶干粉，1％w/v的离析酶干粉和0.4M山梨醇；5)原生质体的制备：将步骤2)处理后的异枝江蓠切成2‑3毫米大小，再用消毒海水冲洗多次，将步骤4)所得原生质体分离液加入异枝江蓠中，在pH 6.5，28℃下，90r/min摇床上遮光酶解4小时，酶解后用45μm的尼龙网进行过滤，取滤液在25℃下离心处理后弃掉上清，加含0.6M山梨醇的MES培养液重悬原生质体，重复离心处理多次。