[发明专利]一种细胞内胆固醇敏感度和定位的测量方法及其诊断试剂

摘要

本发明公开了一种细胞内胆固醇敏感度和定位的测量方法及其诊断试剂，包括新鲜分离的PBMC细胞并涂片固定、游离胆固醇，内质网和线粒体特异的荧光双探针孵育，双探针标记、细胞内萤光定量和校正四大步骤。证据表明血液中胆固醇含量与主动脉和冠状动脉组织内的胆固醇浓度以及动脉粥样硬化的程度没有明确的正相关性。人体内有多个胆固醇池，在一定的致病因子的作用下，胆固醇的可以发生向细胞器的重新分布，定位检测细胞内胆固醇水平(而不是单纯的测量血液胆固醇浓度)具有更重要的意义。

主权项

一种胆固醇敏感度的测量方法，其特征在于：包括LDL标准品的制备、细胞培养方法、RNA提取方法以及一步法荧光定量RT‑PCR四大步骤；其中，LDL标准品的制备具体步骤如下：(一)、取健康自愿者血浆，加入抗氧化剂；(二)、10000g以下离心30min，去除乳糜微粒；(三)、然后加溴化钠将血浆以密度调整为1.006kg/L，40000r/min超速离心18h，吸出上层乳白色液体及次层淡黄色液体，收集下层液体；(四)、再加入溴化钠(NaBr)调整其终密度为1.063gkg/L，再次40000r/min超速离心24h，吸出上层橙黄色液体即获LDL；其中，细胞培养方法具体步骤如下：(一)、将分离健康人和疾病人群的PBMC，小部分细胞直接用于检测PBMC内胆固醇敏感器SCAP的表达水平；(二)、大部分细胞用含10％的无脂血清的RPMI1640培养基，种在12孔板中，培养12小时；(三)、然后与用上述方法制备的不同浓度的LDL胆固醇，浓度分别为0、25、50、100、200μl/ml，共孵育24小时，然后按照下列方法提取mRNA；其中，RNA提取方法为采用Trizol来提取PBMC的RNA，然后分离RNA；其中，一步法荧光定量RT‑PCR，采用一步法完成反转录和PCR两个过程，不必再取出cDNA；试剂包括经过优化的缓冲液、RT‑PCR MIX，dNTP、Sybr green I染料和MgCl2溶液混合物，并拟使用定量荧光PCR检测PBMC的SCAP的表达水平，以及不同浓度LDL刺激下LDLr和HMGCoAR的mRNA水平,并计算50％LDLr和HMGCoAR被抑制时LDL胆固醇的浓度，反映细胞/机体对胆固醇的敏感度，根据不同浓度LDL状态下，LDLr和HMGCoAR mRNA的水平，计算出IC50。