[发明专利]一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法

摘要

本发明提供了一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法，属于蔬菜生物技术育种技术领域，包括将含有GUS基因植物表达载体的根癌农杆菌接种侵染黄瓜子叶节外植体；将侵染的外植体置于共培养基上培养；共培养后，切除外植体2/3的子叶，保留外植体的子叶节区，浸没于GUS染色液中染色、脱色；根据GUS组织化学染色部位和染色面积进行染色分级，确定归属每个GUS基因瞬时表达级别的外植体数目，得GUS基因瞬时表达指数，GUS基因瞬时表达指数值位于区间(55.56～77.77]，为敏感基因型。本发明的方法准确地评价不同基因型黄瓜对农杆菌侵染的敏感性，解决了传统GUS基因瞬时表达率难以区分不同基因型农杆菌敏感性的问题。

主权项

1.一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法，包括以下步骤：/n1)将含有GUS基因植物表达载体的根癌农杆菌固态接种侵染黄瓜子叶节外植体，得到侵染外植体；/n2)将所述步骤1)得到的侵染外植体置于共培养基上黑暗培养，得到黑暗培养后的外植体；/n3)对所述步骤2)得到的黑暗培养后的外植体进行处理，仅保留外植体的子叶节区，将处理后的外植体浸没于GUS染色液中染色10～12h，再置于乙醇溶液中脱色12～15h，得到除去叶绿素的外植体；/n4)根据步骤3)中除去叶绿素的外植体的GUS蓝色部位和显色面积进行GUS组织化学染色分级，确定归属每个GUS基因瞬时表达级别的外植体数目，根据式I所示公式和分级情况计算得到GUS基因瞬时表达指数，当所述GUS基因瞬时表达指数的范围值位于区间(55.55,77.77]时，判定待测黄瓜基因型为黄瓜根癌农杆菌敏感基因型；/n所述GUS组织化学染色分级分为5个GUS基因瞬时表达级别：/n0级 无GUS蓝色；/n1级 GUS蓝色的的组织或细胞部位呈点状分布，蓝色面积≤子叶节区面积的25％；/n2级 子叶节区面积的50％≥蓝色面积>子叶节区面积的25％，染色部位位于不定芽再生部位之外；/n3级 子叶节区面积的75％≥蓝色面积>子叶节区面积的50％，染色部位位于不定芽再生部位；/n4级 蓝色面积>子叶节区面积的75％，染色部位位于不定芽再生部位，所述4级为GUS基因瞬时表达级别的最高级别；/n