[发明专利]单分子水平观测气孔保卫细胞膜蛋白分布和动态的方法

摘要

单分子水平实时观测植物气孔保卫细胞膜蛋白分布和动态的方法，涉及生物技术领域。该方法包括以下步骤：A、获得荧光标记目的基因的转基因材料；B、以全内反射荧光显微镜获取保卫细胞膜蛋白的实时影像；C、通过Image J软件将所得时间序列图像进行处理；D、通过Matlab R2014a对目的蛋白进行单颗粒追踪分析，确定单个蛋白聚合体的动态；E、计算气孔保卫细胞膜蛋白在细胞质膜上的停留时间；F、对目的蛋白的停留时间参数进行高斯拟合，确定目的蛋白的停留时间及变化。此方法具有提高成像的信噪比，可进行高分辨率的观测，成像速度快，活体可视化及可重复性高的优点。本发明在植物基因功能研究中具有实际应用价值。

主权项

1.一种单分子水平实时观测植物气孔保卫细胞膜蛋白分布和动态的方法，包括以下步骤：A步骤、将目的蛋白的基因插入到表达载体中，与编码荧光标记蛋白的基因融合，通过农杆菌侵染得到转基因植株，在所述转基因植株中实现对目的蛋白的荧光标记；B步骤、使用100X、数值孔径为1.45的镜头，滴加镜油，调节488nm激光入射角度数值为1.325，调节激光强度到物镜出口激光强度为1mW；在此物理条件下，曝光时间为100ms，电子增益为300，用20Hz频率对样品进行时间序列成像，每两帧图像之间时间间隔为0，获得连续的时间序列图像200帧；C步骤、对所获得的时间序列图像进行Subtract Background处理；D步骤、对所获得的时间序列图像进行单颗粒追踪，应用软件Matlab R2014a，获得每个时间点的图像中每个荧光点的坐标信息以及荧光强度信息，综合时间和荧光点坐标信息，计算目的蛋白的运动轨迹；E步骤、综合时间和荧光强度信息，对目的蛋白的停留时间动态进行分析；F步骤、对气孔保卫细胞膜蛋白停留时间进行高斯拟合。