[发明专利]一种鉴定烟草内生真菌多样性的方法

摘要

本发明提出了一种鉴定烟草内生真菌多样性的方法，包括烟草基因组DNA的提取、PCR扩增真菌的ITS‑rDNA基因、PCR产物的测序、克隆文库的构建测序、Blast序列比对和系统发生树的构建。本发明提供一种快速鉴定烟草内生真菌多样性的方法，实现通过烟草DNA的提取，直接利用真菌的ITS‑rDNA基因进行扩增，节约了时间成本，突破了传统的分离鉴定方法，省去了大量菌丝样本的获得和培养，同时也可以鉴定到一些不可培养的内生真菌种类，会很大程度上提高工作效率；同时通过克隆文库的构建测序，不但可以降低实验成本，也有效的提高了烟草内生真菌多样性获得的几率，对于快速检测烟草内生真菌的种类、有目的的进行目标菌丝的分离纯化具有重要的指导意义。

主权项

1.一种鉴定烟草内生真菌多样性的方法，其特征在于：包括烟草基因组DNA的提取、PCR扩增真菌的ITS‑rDNA基因、PCR产物的测序、克隆文库的构建测序、Blast序列比对和系统发生树的构建，具体步骤如下：(1)取0.1g烟草叶片于预先加入液氮的研钵中充分研磨，然后转入预先加入600μL CTAB的1.5mL Eppendorf管中，涡旋振荡混匀；(2)加入2μL巯基乙醇，混匀后放入65℃水浴30min，每隔10min振荡混匀1次；(3)室温冷却后加入600μL氯仿，轻柔颠倒混匀，室温乳化20‑30min；(4)在室温下12000rpm离心10min后，转移上清至另一干净离心管中，加入事先在‑20℃下预冷、体积为上清液2/3的异丙酮，颠倒混匀约1‑2min，出现白色絮状沉淀，置于‑20℃下沉淀30min；(5)在室温下12000rpm离心1min，收集沉淀DNA，加入1mL 75％乙醇，在75％乙醇中漂洗沉淀DNA10min以上，1000rpm离心10min，吸除乙醇，置于37℃恒温箱中干燥5min；(6)用500μL无菌水溶解沉淀DNA，向DNA粗提物中加入5μL RNA酶，轻柔混匀置于37℃条件下30min；(7)加入体积比为25∶24∶1的酚∶氯仿∶异戊醇，其中酚与上清液等体积，轻轻颠倒混匀，乳化10min，12000rpm离心10min，转移上清至1.5mL Eppendorf管中；(8)重复步骤(7)；(9)加入与上清液等体积的异丙醇，冰浴沉淀30min，12000rpm离心1min，收集管底沉淀DNA，加入500μL 75％乙醇漂洗两次，1000rpm离心10min，吸除乙醇，置于37℃中干燥至出现半透明状；(10)加入200μL无菌水溶解沉淀DNA，保存于‑20℃备用；(11)检测DNA的纯度和浓度；(12)以提取的DNA为模板，以ITS1和ITS4通用引物进行PCR扩增，PCR扩增得到的产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测后按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒所提供的说明进行胶回收；(13)对回收得到的DNA进行浓度和纯度检测，合格后进行连接转化、克隆，挑取200个克隆，对克隆获得的阳性菌株测序；(14)将所测的序列在NCBI上进行Blast序列比对，进行系统发育分析，构建系统发生树，确定菌株的分类地位。