[发明专利]一种人子宫内膜腺上皮细胞的分离培养方法及优化培养基

摘要

本发明公开一种人子宫内膜腺上皮细胞的分离培养方法及优化培养基，该优化培养基包括DMEM培养基、F‑12 Nutirient Mix培养基、0.5mg/ml的氢化可的松、胎牛血清、25ug/ml的表皮生长因子、5mg/ml的胰岛素、11.7uM的霍乱毒素、10mM的ROCK1抑制剂、10mM的BMP4拮抗剂、10mM的WNT拮抗剂。本发明分离培养人子宫内膜腺上皮细胞的方法，通过将胶原酶IV和Accumax细胞分散液联合消化获得的腺上皮细胞培养于本发明优化的培养基中，使分离得到的人子宫内膜腺上皮细胞传代培养至P1代呈克隆增值，可以有效地将人的子宫内膜腺上皮细胞在体外培养2代，为人子宫内膜腺上皮细胞进行体外细胞互作模型研究提供了一定量的种子细胞。

主权项

一种人子宫内膜腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于：包括如下步骤：1)收集人子宫内膜：从因宫腔黏连、子宫肌瘤、内膜增生等病因的患者，经宫腔镜下异物钳取粘连组织表面的少量内膜，剪碎至细小组织碎片于无菌离心管中，在4℃条件下用PBS缓冲液进行旋转漂洗10次，30min/次后，弃去PBS缓冲液，备用；2)分离人子宫内膜上皮细胞：于清洗好的组织碎片中加入3mg/mL胶原酶IV，在37℃条件下旋转消化10‑15min后，再加入Accumax细胞分散液继续混合，在37℃条件下旋转消化7‑10min后，加入血清至终浓度，得到达到终止消化的组织悬液；3)收集子宫内膜上皮细胞：将组织悬液通过200目的细胞滤筛进行过滤后，以1000r/min的转速离心5min，弃上清，沉淀的细胞用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基进行悬浮；4)培养贴壁细胞：将悬浮的细胞接种到无胶原包被的培养皿中进行培养，培养2小时，细胞贴壁成为纤维细胞，加入正常培养基继续培养；5)收集未贴壁的细胞；收集未贴壁的细胞悬液(即为子宫内膜腺上皮细胞或细胞团块)于离心管中，以1000r/min的转速离心5min，弃上清后，将沉淀的细胞用优化的培养基进行再悬浮；6)获得原代培养的子宫内膜腺上皮细胞(P0)：将收集悬浮的未贴壁的细胞接种于鼠尾胶原包被的细胞培养皿上，加入优化的培养基，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养2‑3d后，进行换液，即得子宫内膜腺上皮细胞(P0)；7)传代培养子宫内膜腺上皮细胞：待获得的原代培养的气道上皮细胞的融合率达80‑90％时，吸去培养基，用预热的PBS缓冲液漂洗后，加入优化培养基进行传代培养。