[发明专利]一种提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎率发生的方法

摘要

本发明公开了一种提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,将芥菜、小白菜无菌花药与结球甘蓝小孢子混合悬浮液共同培养,培养得到的胚状体在初期即可确定是结球甘蓝的胚状体,因为结球甘蓝小孢子是游离状态的,而芥菜、小白菜小孢子在花药中,因此在再生植株移栽时不需要对小孢子植株群体的芥菜、小白菜植株进行区别鉴定,从而减少了工作量,从而提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子出胚效率。 1

主权项

1.一种提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法，其特征在于主要包括以下步骤:

(1)选取结球甘蓝、芥菜、小白菜处于单核晚期至双核早期阶段的干净无污染花蕾,将花蕾保湿置于4℃处理1‑3d备用；花蕾灭菌消毒用体积比75%酒精消毒60s，质量比8%的次氯酸钠溶液表面消毒20min,无菌水冲洗5次；

(2)将20‑25个无菌结球甘蓝花蕾置于无菌烧杯中,加入15‑20ml pH6.0 NLN‑13液体培养基,采用挤压法游离小孢子,然后用450目尼龙网过滤,将滤液收集于离心管,1000r.min^‑1离心5min,弃上清液后得到沉淀,然后依次加入pH6.0 NLN‑13液体培养基,调整小孢子密度为1.5×10⁵~2×10⁵个ml^‑1,并加入100µl的活性炭混合液,分装到15‑20个直径为60mm的塑料或玻璃无菌培养皿中,每培养皿3‑4ml;

(3)剥取无菌芥菜、小白菜花蕾,取出完整花药加入到步骤(2)中的培养皿中,芥菜、小白菜花蕾与结球甘蓝花蕾数量比为3:3:1～5:5:1,加盖后封口;

(4)将步骤(3)中得到的加盖封口的培养皿置于32.5℃恒温培养箱热激处理24h,再转移到25℃条件下静置黑暗培养15‑20天至肉眼可见胚状体出现后,置于摇床70‑80rpm、25℃黑暗培养胚状体发育到成熟的子叶型胚状体；

 (5)无菌条件下,将步骤(4)中得到的成熟的子叶型胚状体转接至胚状体分化培养基B5培养基中,18 h.d^‑1、5000Lx，24±1℃条件下培养18‑20天至形成愈伤组织或直至分化出芽，再按大小将愈伤组织切成3‑5块置于生根培养基中生根培养形成再生植株, 生根培养的条件为25℃、5000Lx、16h.d^‑1;

(6)步骤(5)中得到的再生株长到含4‑5片叶的健壮苗时,在培养室内开瓶炼苗,驯化移栽到装有灭菌基质的营养钵中,于25℃下12h光照和12h黑暗交替静值培养,1周后营养钵放置外界阴凉处,逐步炼苗,3周后将其移栽到大田,获得植株；经倍性鉴定后,获得的纯合双单倍体再生植株用于育种。

2.根据权利要求1所述的提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,其特征是，所述结球甘蓝的花瓣和花药长度比为0.5‑1.0，芥菜的花瓣和花药长度比为0.4‑0.8，小白菜的花瓣和花药长度比为0.6‑0.9。

3.根据权利要求1所述的提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,其特征是，在步骤（1）前分别进行周年采集结球甘蓝、芥菜、小白菜花蕾供小孢子培养。

4.根据权利要求1所述的提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,其特征是，所述NLN‑13液体培养基组成为:NLN液体培养基1L、蔗糖125‑130g，0.05 mg 6‑BA,15 mg AgNO₃和0.05 mg 2,4‑D；pH为5.8‑6.2。

5.根据权利要求1所述的提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,其特征是，所述活性炭混合液的组成为:NLN液体培养基1L、琼脂糖6‑10g、活性炭4‑6g。

6.根据权利要求4或5所述的提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,其特征是，NLN液体培养基,以1L计,组成为:

KNO₃                   125mg,

Ca(NO₃)₂·4H₂O         500mg,

MgSO₄·7H₂O            125mg,

kH₂PO₄,                125mg,

H₃BO₃                  6.2mg,

MnSO₄·H₂O             18.95mg,

ZnSO₄·7H₂O            8.6mg,

Na₂MoO₄·2H₂O          0.25mg,

CuSO₄·5H₂O            0.025mg,

CoCL₂·6H₂O            0.025mg,

维生素B1              0.5mg,

维生素B6              1.0mg,

生物素                0.05mg,

叶酸                  0.5mg,

Na₂EDTA               37.3mg,

FeSO₄·7H₂O            27.8mg,

肌醇                  100mg,

甘氨酸                2mg,

烟酸                  5mg,

L‑谷氨酞胺            800mg,

谷肤甘肽              30mg,

维生素B5              5mg,

丝氨酸                100mg，

和余量的无菌水,

pH5.9‑6.1。

7.根据权利要求1所述的提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,其特征是，所述胚状体分化培养基组成为:B5培养基1L、蔗糖35‑40g、琼脂8‑11g, 6‑BA 0.2mg，活性炭2‑4g，pH为5.8‑6.1。

8.根据权利要求7所述的提高结球甘蓝低出胚基因型小孢子胚胎发生率的方法,其特征是，B5培养基,以1L计,组成为:

NaH₂PO₄·2H₂O          169.5mg,

KNO₃                          2500mg,

(NH4)₂SO₄              134mg,

MgSO