[发明专利]一种多能干细胞及其分化的T细胞和应用

摘要

本发明提供了一种多能干细胞及其分化的T细胞和应用，所述多能干细胞包含有Runx1和Hoxa9串联共表达载体。本发明将外源Runx1和Hoxa9共表达载体引入多能干细胞中，成功构建了诱导性共表达外源Runx1和Hoxa9的多能干细胞，所述多能干细胞定向分化为T谱系祖细胞，并将发育为T细胞。使用本发明的方法获得的多能干细胞来源的T细胞，不仅功能正常，而且没有致瘤风险。

主权项

1.一种采用多能干细胞定向分化T细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将Runx1和Hoxa9串联的表达载体通过基因重组整合到多能干细胞的Rosa26位点，并采用潮霉素B进行抗性筛选；(2)将步骤(1)所述多能干细胞定向分化为造血干细胞前体细胞，具体为依次采用D0培养基、D2.5培养基、D3培养基、D4培养基、D5培养基、D6培养基和D7培养基培养，在第11天定向分化为造血干细胞前体细胞；(3)将步骤(2)所述造血干细胞前体细胞与小鼠骨髓基质细胞OP9‑DL1细胞共培养，采用强力霉素进行诱导，得到T谱系祖细胞；(4)诱导步骤(3)所述T谱系祖细胞分化为TCRβ细胞和/或TCRγ/δ细胞；其中，步骤(1)所述多能干细胞为基因编辑后的诱导性多能干细胞和/或胚胎多能干细胞系；所述D0培养基为含有3‑8ng/mL骨形态发生蛋白4的基础分化培养基；所述D2.5培养基为含有3‑8ng/mL激活素A和3‑8ng/mL碱性成纤维细胞生长因子的基础分化培养基；所述D3培养基为含有3‑8ng/mL激活素A、3‑8ng/mL骨形态发生蛋白4和3‑8ng/mL血管内皮生长因子的基础分化培养基；所述D4培养基为含有3‑8ng/mL骨形态发生蛋白4和3‑8ng/mL血管内皮生长因子的基础分化培养基；所述D5培养基为含有3‑8ng/mL骨形态发生蛋白4、3‑8ng/mL血管内皮生长因子、10‑30ng/mL重组小鼠白介素3、10‑30ng/mL重组小鼠白介素6、10‑30ng/mL重组小鼠干细胞因子、10‑30ng/mL重组人促血小板生成素和10‑30ng/mL人Fms相关酪氨酸激酶3配体的基础分化培养基；所述D6培养基为含有3‑8ng/mL骨形态发生蛋白4、3‑8ng/mL血管内皮生长因子、10‑30ng/mL重组小鼠白介素3、10‑30ng/mL重组小鼠白介素6、10‑30ng/mL重组小鼠干细胞因子、10‑30ng/mL重组人促血小板生成素、10‑30ng/mL人Fms相关酪氨酸激酶3配体和1‑2μg/mL强力霉素的基础分化培养基；所述D7培养基为含有10‑30ng/mL重组小鼠白介素3、10‑30ng/mL重组小鼠白介素6、10‑30ng/mL重组小鼠干细胞因子、10‑30ng/mL重组人促血小板生成素、10‑30ng/mL人Fms相关酪氨酸激酶3配体和1‑2μg/mL强力霉素的基础分化培养基；所述基础分化培养基为含有10‑20％胎牛血清、180‑220μg/mL铁饱和转铁蛋白、4.5×10^‑4M硫代甘油、1‑3mM GlutaMAX^TM‑I添加剂、0.4‑0.6mM抗坏血酸的IMDM培养基。