[发明专利]生产高产重组腺相关病毒(rAAV)载体可扩展高回收法及其产生的重组腺相关病毒(rAAV)载体在审
申请号: | 201780045164.8 | 申请日: | 2017-07-21 |
公开(公告)号: | CN109790549A | 公开(公告)日: | 2019-05-21 |
发明(设计)人: | 曲光;约翰·弗雷泽·莱特;吴永勋;王玉环;张海波;劳拉·邓肯 | 申请(专利权)人: | 星火治疗有限公司 |
主分类号: | C12N15/861 | 分类号: | C12N15/861;C12N7/00;A61K48/00;C07K2/00;C12N15/64 |
代理公司: | 上海胜康律师事务所 31263 | 代理人: | 樊英如;邱晓敏 |
地址: | 美国宾夕*** | 国省代码: | 美国;US |
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摘要: | 提供了以高回收率或高滴度产生重组腺相关病毒(rAAV)载体颗粒的方法。还提供了将rAAV载体浓缩至高浓度的方法,例如,高达5E+13(5×1013)个载体基因组/毫升(Vg/ml),几乎没有任何rAAV聚集体。 | ||
搜索关键词: | 重组腺相关病毒 载体基因组 高回收率 载体颗粒 载体提供 高滴度 聚集体 可扩展 浓缩 高产 回收 生产 | ||
【主权项】:
1.一种以高回收率或高滴度产生重组腺相关病毒(rAAV)载体颗粒的方法,所述方法包括以下步骤:(a)收获包含rAAV载体颗粒的细胞和/或细胞培养上清液;(b)任选地通过切向流过滤任选地浓缩在步骤(a)中收获的所述细胞和/或所述细胞培养物上清液,以产生浓缩的收获物;(c)任选地通过微流化裂解在步骤(a)中产生的所述收获物或在步骤(b)中产生的所述浓缩收获物以产生裂解物;(d)过滤步骤(c)中产生的所述裂解物以产生澄清的裂解物;(e)将步骤(d)中产生的所述澄清的裂解物进行离子交换柱层析,以产生包含纯化的rAAV载体颗粒的柱洗脱液,并任选通过切向流过滤浓缩所述柱洗脱液,以产生浓缩的柱洗脱液;(f)将在步骤(e)中产生的所述柱洗脱液或所述浓缩的柱洗脱液与氯化铯混合以产生混合物,并使所述混合物进行梯度超速离心以基本上从空衣壳AAV颗粒和其他AAV载体相关杂质分离出真正的rAAV载体颗粒;(g)(1)收集在步骤(f)中分离的所述真正的rAAV载体颗粒,以及(g)(2)在具有非离子表面活性剂的缓冲液中配制所收集的所述真正的rAAV载体颗粒;(h)将步骤(g)(2)中的所述真正的rAAV载体颗粒通过切向流过滤进行缓冲液交换以产生AAV载体制剂;以及(i)过滤步骤(h)中产生的所述AAV载体制剂,从而以高回收率或高滴度产生真正的rAAV载体颗粒制剂。
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