[发明专利]用于快速克隆T细胞受体的组合物和方法

摘要

提供了用于克隆T细胞受体(TCR)的方法、组合物、重组DNA分子和试剂盒。该方法有助于从含有抗原特异性T细胞的生物样品构建TCR表达文库，所述生物样品包括但不限于肿瘤活组织检查物，其中包括冷冻的肿瘤活组织检查物。用源自文库的TCR基因工程化的外周T细胞示出有效的治疗性抗肿瘤效果。该方法可以采用任何含有T细胞的样品进行，并且可以用寡克隆T细胞群体(如已经浸润肿瘤的T细胞)进行。提供了用于第一链cDNA合成、第二链cDNA合成和用于将多种不同的TCRβ链和TCRα链克隆到多种载体中的引物组合。提供了含有载体的细胞，以及用于快速克隆TCRβ链和TCRα链的试剂盒。

主权项

1.一种从寡克隆T细胞群体的T细胞受体(TCR)克隆多种TCRα链和β链可变序列的方法，所述方法包括：1)从所述寡克隆T细胞群体获得RNA，其中所述RNA包含编码TCRα链和β链可变序列的mRNA，并且从所述mRNA产生第一单链cDNA，其中所述第一单链cDNA包括编码所述TCRα链的单链cDNA和编码所述TCRβ链的单链cDNA，其中采用寡聚dT引物通过逆转录产生所述单链cDNA以获得从所述mRNA扩增的第一链cDNA的样品；2)将1)中的所述样品分成第一样品和第二样品并且进行聚合酶链式反应(PCR)，所述反应包括：采用以下所有引物在所述第一样品中进行第二链cDNA合成以获得编码所述TCRβ链的双链cDNA扩增子，采用以下所有引物在所述第二样品中进行第二链cDNA合成以获得编码所述TCRα链的双链cDNA扩增子，3)将所述第一样品和所述第二样品与核酸外切酶孵育一段时期，以足以降解未合并到所述扩增子的引物和可能存在的单链cDNA，随后利用热处理使所述核酸外切酶失活；4)采用标签特异性引物HTTCR#A‑ACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCTGCGGCCGCCACCATG(SEQ ID NO：1)和引物HTTCR#B‑CTCAAACACAGCGACCTCGGGTGGGAACAC(SEQ ID NO：2)在所述第一样品中对编码TCRβ链的扩增子进行PCR扩增以获得所述编码TCRβ链的扩增子，其中所述编码TCRβ链的扩增子还包含限制性核酸内切酶识别位点、Kozak序列和翻译起始ATG序列；采用标签特异性引物HTTCR#D GGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCCATG(SEQ ID NO：48)和HT‑TCR#E AGGCAGACAGACTTGTCACTGGATTTAGAG(SEQ ID NO：49)在所述第二样品中对编码TCRα链的扩增子进行PCR扩增以获得所述编码TCRα链的扩增子，其中所述包含TCRα链的扩增子还包含P2A序列和起始ATG序列；和5)将4)中的所述编码TCRβ链的扩增子和所述编码TCRα链的扩增子组装成DNA载体，以提供多种DNA载体，每种DNA载体包含编码仅一种TCRβ链和仅一种TCRα链的DNA区段，其中所述载体包含编码TCRβ链的区段和编码TCRα链的区段之间的Cβ‑2A融合区段，从而提供多种DNA载体，所述多种DNA载体中的每种载体仅编码所述寡克隆T细胞群体的所述TCR的单种TCRβ链和单种TCRα链。